Co to jest PCR MP?

PCR to reakcja łańcuchowa polimerazy (ang. polymerase chain reaction), metoda powielania DNA w warunkach laboratoryjnych. Co zatem oznacza MP? Jest to akronim angielskich słów melting profile, które na język polski można przetłumaczyć jako „profil topnienia”.

Metoda PCR MP została opracowana w roku 2003 przez polskich naukowców – Aleksandra Masnego i Andrzeja Płucienniczaka i oparta jest o technikę ligacji adaptorów oligonukleotydowych (LM PCR).

Wykonanie analizy

PCR MP wykorzystuje dwa zjawiska. Fragmenty, które powstają po trawieniu genomowego DNA różnią się temperaturą topnienia, zaś fragment DNA może być powielany w reakcji PCR tylko po całkowitej jego denaturacji. Stosując obniżoną temperaturę denaturacji otrzymuje się mniejszą liczbę fragmentów DNA, niż przy standardowej temperaturze 94-95°C, w której to amplifikacji uległyby wszystkie fragmenty.

Genomy bakteryjne wykazują znaczną różnorodność w zawartości par GC. Oznacza to, że po trawieniu genomowego DNA powstają fragmenty o różnej trwałości termicznej. Uzyskane w ten sposób zestawy wzorów elektroforetycznych są charakterystyczne dla danego genomu i enzymu restrykcyjnego.

rys. 1. Zdjęcie wzorów uzyskanych na żelu poliakrylamidowym podczas genotypowania Klebsiella oxytocya metodą PCR MP.

Cała procedura składa się zasadniczo z 5 etapów:

• trawienia genomowego DNA jednym enzymem restrykcyjnym stosunkowo często tnącym pozostawiającym wiszące 5’ końce
• ligacji adaptora oligonukleotydowego
• wypełnianiu końców 5’ fragmentów niosących potencjalne miejsca wiązania startera w tzw. pre – PCR
• zasadniczej reakcji PCR w obniżonej temperaturze
• oraz analizy uzyskanych produktów na żelu poliakrylamidowym wybarwionym bromkiem etydyny

Jednak przed przeprowadzeniem zasadniczej reakcji należy pamiętać o kilku ważnych etapach wstępnych:

• kalibracji termocyklera
• dobraniu eksperymentalnie optymalnego gradientu temperaturowego, w którym wzrost długości amplifikowanych fragmentów DNA będzie równomierny
• ustaleniu temperatury, w której wyniki będą powtarzalne oraz będą miały odpowiednią siłę różnicującą

Ogromnymi zaletami opisywanej metody są: możliwość stosowania jej do analizy genomów o nieznanej sekwencji pochodzących z różnych źródeł, duża powtarzalność i potencjał różnicujący oraz łatwość analizy otrzymanych wyników.

Rys. 2. Gradient temperaturowy jednego ze szczepów Klebsiella oxytocya

Zastosowanie

Technika PCR MP jest z powodzeniem stosowana w diagnostyce mikrobiologicznej.

Do dnia dzisiejszego została wykorzystana do różnicowania zarówno mikroorganizmów bakteryjnych ( m. in. Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus ureus, Enterococcus faecium, Clostridium difficile, Pseudomonas aeruginosa, Propionibacterium acnes), dermatofitów, jak i drożdżaków z rodzaju Candida.

Metoda PCR MP może być również wykorzystywana przy różnego rodzaju badaniach epidemiologicznych. Pozwala na wykrywanie zakażeń szpitalnych oraz odróżnienie szczepów endemicznych od epidemicznych. Dzięki niej można ustalić jaki szczep jest dominujący na danym oddziale czy w szpitalu. Również w badaniu sytuacji epidemiologicznej poszczególnych pacjentów PCR MP jest nadzwyczaj użytecznym narzędziem.

Technika ta mogłaby się sprawdzić też przy kontroli stabilności szczepów bakteryjnych w zakładach przemysłowych oraz kolekcjach mikroorganizmów.

PCR MP została wykorzystana również do wykrywania mutacji punktowych. Dzięki niej wykryto delecję jednego nukleotydu (adeniny), która powodowała różnice w  stabilności termicznej amplifikowanego fragmentu.

W chwili obecnej „złotym standardem” w genotypowaniu drobnoustrojów jest technika PFGE oraz metody oparte na hybrydyzacji DNA-DNA, które są dość kosztowne i trudne do przeprowadzenia. Za to bardziej rozpowszechnione metody takie jak RAPD, czy AFLP, mimo dużej siły dyskryminującej są mało powtarzalne pomiędzy laboratoriami, a ich wyniki są trudne do analizy. Tutaj pojawia się szansa dla techniki PCR MP, która w niedługim czasie może stać się cennym narzędziem stosowanym rutynowo w diagnostyce mikrobiologicznej.

Literatura:

1) Masny A., Płucienniczak A., Ligation mediated PCR performed at low denaturation temperatures—PCR melting profiles., Nucleic Acid Research, (2003) 31, e114

2) Krawczyk B., Leibner J., Samet A., Kur J., Technika PCR MP (PCR melting profile) – możliwości zastosowania w badaniach epidemiologicznych., Med. Dośw. Mikrobiol., (2007) 59: 5-16

3) Krawczyk B., Diagnostyka molekularna w zakażeniach szpitalnych., Post. Mikrobiol., (2007) 46: 367-378

4) Krawczyk B., Samet A., Leibner J., Śledzińska A., Kur J., Evaluation of a PCR melting profile (PCR MP) technique for Bacteria strain differentiation., J. Clin. Microbiol., (2006) 44: 2327-2332

5) Krawczyk B., Leibner J., Stojowska K., Bronk M., Samet A., Kur J., PCR Melting Profile method for genotyping analysis of vancomycin-resistant Enterococcus faecium isolates from Hematological unit patients., Pol. J. Microbiol., (2007) 56: 65-70

6) Krawczyk B., Leibner-Ciszak J., Mielech A., Nowak M., Kur J., PCR melting profile (PCR MP) – a New tool for differentiation of Candida albicans strains., BMC Infect Dis., (2009) 9: 177

7) Leibner-Ciszak J., Dobrowolska A., Krawczyk B., Kaszuba A., Stączek P., Evaluation of PCR MP method for intra-species differentiaion of Trichophyton rubrum and Trichophyton mentagrophytes., J. Med. Microbiol., (2010) 59: 185-192

opracował Adrian Arendowski