Istnieje kilka sposobów ustalania liczby komórek: poprzez badanie mikroskopowe, za pomocą elektronicznych liczników cząstek lub pośrednio poprzez pomiar włączania promieniotwórczych prekursorów, określanie ilości białka całkowitego przy użyciu barwników chromogennych lub poprzez pomiar aktywności metabolicznej enzymów komórkowych.

Najpopularniejszym testem wykorzystywanym do analizy proliferacji komórek jest włączenie 3H-tymidyny do DNA komórek. Test ten jest jednak bardzo pracochłonny, ponieważ wymaga usunięcia nadmiaru, niezwiązanego znacznika.

W 1956 roku został opublikowany pierwszy dokument na temat stosowania soli tetrazolu jako wskaźnika żywotności komórek. Metoda ta opiera się na stwierdzeniu, że żywe komórki są zdolne do redukcji nieznacznie zabarwionych lub bezbarwnych soli tetrazolu do intensywnie zabarwionych pochodnych formazanu. Proces ten wymaga funkcjonowania mitochondriów, które są inaktywowane w ciągu kilku minut po śmierci komórki. Metoda ta stanowi zatem doskonałe narzędzie do dyskryminacji żywych i martwych komórek. Jednakże początkowo stosowane sole tetrazolu miał kilka wad, w tym nierozpuszczalnośd powstających pochodnych formazanu. Potrzebne były czaso- i pracochłonnych procedury ich rozpuszczania, w tym wielokrotne pipetowanie i mieszanie lub stosowanie niebezpiecznych solubilizatorów. Zabiegi te jednak nieodwracalnie kooczyły proliferację komórek, a tym samym uniemożliwiły przedłużanie inkubacji w celu osiągnięcia zwiększonej wrażliwości lub kontynuowanie hodowli komórkowej. Niedogodności te doprowadziły do opracowania nietoksycznych soli tetrazolu dających rozpuszczalne produkty redukcji. Chociaż procedura testu została znacznie uproszczona przez zastosowanie barwników rozpuszczalnych, w praktyce jej wykorzystanie było ograniczone ze względu na niestabilnośd barwnika formazanu i stosunkowo niską absorbancję produktu koocowego w porównaniu do klasycznego testu MTT.

Dział badawczy BIOMEDICA rozwiązał oba problemy i stworzył łatwy w wykorzystaniu, szybki i niezawodny nieizotopowy test proliferacji komórek. Dla wygody, zrobiono test o dużej zgodności ze standardowym testem włączenia tymidyny. W związku z tym, żadne zmiany nie są wymagane podczas przygotowania testu i procedury znakowania. Ponadto nie ma potrzeby usuwania pożywki przed lub po dodaniu chromogennego substratu. Praca wykonana przez zespół BIOMEDICA zaowocowała testem, który łączy w sobie najlepsze cechy metod włączania tymidyny i MTT, a mianowicie: dokładnośd, szybkośd, niezawodnośd oraz prostotę wykonania. Ponadto, według naszych danych uzyskanych do tej pory chromofory wydają się być nietoksyczne.

EZ4U - test oceny proliferacji komórek i cytotoksyczności firmy Biomedica – to test oceny proliferacji komórek i cytotoksyczności EZ4U opiera się na zdolności żywych komórek do redukcji nieznacznie zabarwionych lub bezbarwnych soli tetrazolu w mitochondriach do intensywnie zabarwionych pochodnych formazanu. Rozpuszczalny w wodzie formazan wydzielany jest do pożywki i może być mierzony za pomocą zwykłego czytnika ELISA. EZ4U doskonale nadaje się do różnych badań biologicznych, w których żywotność komórek ma znaczenie. Ze względu na rozpuszczalność jego końcowych produktów jest łatwiejszy i szybszy w wykonaniu niż inne nieradioaktywne testy żywotności komórek. Ważną zaletą jest możliwość dalszej hodowli po określeniu liczby komórek oraz łatwość dostosowania czasu inkubacji ze względu na nietoksyczny substrat.

red. Blanka Majda