Joanna Wojsiat, współpracująca z nami od kilku miesięcy redaktor działu Biotechnologia, łączy pisanie tekstów na potrzeby naszego portalu i Kwartalnika ze studiami doktoranckimi w Instytucie Biologii Doświadczalnej im. M. Nenckiego PAN w Warszawie, gdzie bada zmiany molekularne zachodzące w komórkach obwodowych w chorobie Alzheimera. Podczas Kongresu BIO 2016 miała zaszczyt zaprezentować wyniki prowadzonych w Laboratorium Badań Przedklinicznych o Podwyższonym Standardzie w Instytucie Nenckiego prac prowadzonych przez prof. Urszulę Wojdę. Wyniki tych doświadczeń są elementami jej pracy doktorskiej dotyczącej zmian molekularnych obserwowanych w komórkach peryferycznych pacjentów z chorobą Alzheimera.  Swoje wystąpienie zatytułowane „Two faces of one disease – difference in cell cycle regulation and apoptotic response between lymphocytes from familial and sporadic Alzheimer's disease patients” miała możliwość  zrealizować w  sesji  “Proteostasis and stress response”, prowadzonej przez prof. Roberta Wysockiego z Uniwerystetu Wrocławskiego.

Przedstawione przez Joannę wyniki, stanowiące część jej pracy doktorskiej, zostały niedawno opublikowane na łamach „Molecular Neurobiology” [1], a idea wykorzystania komórek peryferycznych celem obserwacji zmian dotyczących  m. in. cyklu komórkowego oraz apoptozy ukazała się w pracy przeglądowej w „Journal of Alzheimer Disease” [2] w 2015 roku.

Wyniki wcześniejszych badań zespołu prof. Wojdy wykazały, że w limfocytach pacjentów z rodzinną formą choroby Alzheimera (SAD) poziom białka p21 ulega podwyższeniu w stosunku do limfocytów osobników zdrowych oraz pacjentów z rodzinną formą choroby Alzheimera (FAD) [3]. W związku z tym, że p21 jest białkiem zaangażowanym w regulację cyklu komórkowego oraz odpowiedź apoptotyczną Joanna zdecydowała się wykonać analizę apoptozy bazalnej oraz indukowanej stresem oksydacyjnym w komórkach SAD, FAD oraz kontroli.  Kilkoma metodami cytometrii przepływowej wykazała, że limfocyty pacjentów z rodzinną formą AD charakteryzuje niższa odpowiedź na stres oksydacyjny, a co za tym idzie - apoptoza. Już ta obserwacja pozwoliła wysnuć przypuszczenia o odmiennym mechanizmie molekularnym dwóch typów AD. W następnych krokach nasza młoda badaczka podjęła się analizy poziomu mRNA oraz białka p21, które jak wcześniej wspomniano, jest zaangażowane zarówno w regulację cyklu komórkowego, jak i apoptozy. Istotnym podkreślenia jest fakt, że rola p21 w śmierci komórki zależy od jego lokalizacji w komórce. Jego lokalizacja cytoplazmatyczna indukuje działanie antyapoptotyczne, jądrowa zaś – ma działanie promujące apoptozę. W komórkach SAD po stymulacji poziom białka p21 obniżył się, poziom mRNA zaś uległ podwyższeniu. Natomiast w limfocytach FAD, zgodnie z wcześniej uzyskanymi wynikami dotyczącymi różnic w odpowiedzi apoptotycznej, poziom p21 w warunkach bazalnych był znacznie niższy niż w SAD, ale po stymulacji wzrastał znacznie zarówno na poziomie białkowym, jak i mRNA. Mając na uwadze rolę białka p21 w apoptozie, zależną od jego lokalizacji komórkowej, w dalszym etapie projektu Joanna określiła, w jakim kompartmencie komórki znajduje się p21 po stymulacji apoptotycznej. Wiadomo bowiem, że p21 zlokalizowane w jądrze komórkowym indukuje apoptozę, zaś zlokalizowane w cytoplazmie działa hamująco na śmierć komórki. Analiza Western Blot (WB) wykazała, że poziom p21 we frakcji cytoplazmatycznej jest znacznie wyższy w komórkach SAD w warunkach bazalnych niż w limfocytach pochodzących od zdrowych osobników oraz FAD. W przypadku komórek FAD, zawartość p21 w cytoplazmie była znacznie większa niż w limfocytach SAD i kontrolnych po stymulacji 2dRib. W celu określenia lokalizacji p21 w kompartmencie komórkowym, nasza redaktorka dokonała także oznaczenia immunocytochemicznego białka p21 przy użyciu mikroskopu konfokalnego. Analiza ta potwierdziła zwiększoną ilość białka p21 we frakcji cytoplazmatycznej w warunkach bazalnych w limfocytach SAD, a po stymulacji 2dRib – zwiększenie jego zawartości w jądrze komórkowym. Sytuacja odwrotna miała miejsce w komórkach pacjentów z FAD. Po stymulacji apoptotycznej, białko p21 znajdowało się w większości w cytoplazmie komórki. Wyniki przeprowadzonego doświadczenia wykazały, że w przypadku limfocytów FAD poddanych stymulacji apoptotycznej, białko p21 zlokalizowane jest w cytoplazmie komórki, co odpowiada za antyapoptotyczny mechanizm działania p21 i jest zgodne z tym, że komórki pochodzące od FAD cechowała słabsza odpowiedź apoptotyczna oraz większą przeżywalność.

Regulacja transkrypcji p21 może odbywać się zależnie bądź niezależnie od białka p53. Aby sprawdzić czy wzrost poziomu białka p21 w limfocytach FAD po stymulacji 2dRib jest zależny od p53, Joanna przeprowadziła eksperyment, w którym aktywność białka p53 zablokowała jego specyficznym inhibitorem, pifitryną α (PFTα). Analiza WB wykazała ponownie, że w przypadku limfocytów FAD poziom białka p21 wzrasta znacząco po stymulacji apoptotycznej, jednak jego poziom drastycznie spada, gdy komórki stymulowane są jednocześnie 2dRib oraz inhibitorem p53. Wynik tego doświadczenia wskazuje zatem, że przyrost poziomu p21 po stymulacji apoptotycznej z 2dRib jest zależny od p53, ponieważ w warunkach obniżonej ilości p53 (po zablokowaniu PFTα), a także w obecności 2dRib poziom p21 drastycznie zmalał. Ponadto, analiza Western Blot wykazała, że w przypadku limfocytów FAD poziom fosforylowanej formy p53  również gwałtownie wzrasta. Zmiany te nie występowały w przypadku limfocytów SAD oraz kontroli. Aby sprawdzić, czy zmiany w poziomie p21 oraz p53 przy jednoczesnym stymulowaniu komórek 2dRib oraz PFTα mają wpływ na przeżywalność komórek, doktorantka wykonała analizę cytotoksyczności testem MTT. Wyniki tego eksperymentu wykazały, że przeżywalność komórek stymulowanych jednocześnie 2dRib oraz inhibitorem p53 gwałtownie spada, co nie zostało zaobserwowane podczas traktowania komórek tylko 2dRib oraz PFT. Przeprowadzone doświadczenia wskazują, że wzrost poziomu białka p21 po stymulacji 2dRib oraz zwiększona przeżywalność komórek FAD w tych warunkach doświadczalnych jest zależna od p53, ponieważ zahamowanie tego białka skutkowało znacznie obniżonym poziomem p21 po stymulacji apoptotycznej oraz zmniejszoną przeżywalnością komórek. Warto podkreślić, że zmiany te nie były obserwowane, gdy komórki traktowane były samym 2dRib bądź PFTα.

Dodatkowym aspektem podjętym w ramach projektu była odpowiedź na pytanie, czy zmiany p21 występują we wczesnych etapach AD? W tym celu Joanna określiła poziom białka p21 w limfoblastach pochodzących od pacjentów z łagodnymi zmianami poznawczymi (Mild Cognitive Impairement - MCI) w warunkach bazalnych, jak i w odpowiedzi na 2dRib. Wyniki tych doświadczeń wykazały, że poziom p21 w komórkach MCI jest podwyższony w porównaniu do kontroli oraz znacznie spada po stymulacji apoptotycznej, podobnie jak w limfocytach pochodzących od  pacjentów SAD.

Wyniki przeprowadzonych przez grupę eksperymentów wskazują, że mechanizmy molekularne SAD i FAD są odmienne, w związku z czym te 2 typy AD mogą wymagać odmiennego podejścia terapeutycznego. Ponadto wyniki podjętych przez naszą redaktorkę badań wykazały, że zmiany dotyczące regulacji cyklu komórkowego, takie jak podwyższenie białka p21, obecne są już na wczesnych etapach choroby i rzucają nowe światło na poszukiwanie zmian komórkowych związanych z AD w krwi obwodowej pacjentów.

Bardzo cieszymy się mogąc współpracować z tak ambitną, inteligentną, utalentowaną osobą i mamy nadzieję, że publikacją tego tekstu zrobimy jej miły prezent. Życzymy dalszych sukcesów!