Biotechnologia.pl: Prawdę mówiąc po raz pierwszy spotkałam się z ideą rozszyfrowania zagadki funkcjonowania naszego mózgu za pomocą metodologii, którą dysponuje biologia molekularna, skąd państwa zainteresowanie tą tematyką?

Profesor Leszek Kaczmarek: Jednym z najważniejszych składników umysłu, jest pamięć. Tak się składa, że pamięć jest taką cechą, którą można badać na zwierzętach, dlatego moja droga do poznania umysłu wiedzie przez zrozumienie pamięci. Pamięć w naszych rękach jest swego rodzaju narzędziem. Naszym największym, dotychczasowym sukcesem jest odkrycie, że w procesie uczenia się dochodzi do zmian aktywności genów w mózgu. Badanie prowadzimy na zwierzętach, głównie na myszach i szczurach. Mózg tych gryzoni jest dużo mniejszy niż mózg człowieka, ale jest on podobnie zbudowany i zdolny to tworzenia funkcji umysłowych, podobnie jak mózg człowieka. Odkryliśmy, że gdy zwierzę się czegoś uczy, to wówczas w neuronach mózgu tego zwierzęcia, dochodzi do pojawienia się aktywności genu c-fos, a produktem ekspresji tego genu jest białko c-fos. Gen ten został odkryty jako protoonkogen jądrowy. Wiadomo, o nim, że jest aktywowany w różnych sytuacjach pobudzenia komórki. Zaproponowałem wówczas hipotezę, że pobudzenie komórek nerwowych nie powinno się znacząco różnić od pobudzenia innych komórek. Pobudzenie, skutkuje zazwyczaj długotrwałą zmianą w funkcjonowaniu komórek, a pamięć to nic innego jak taka zmiana w sieci neuronów. Szukaliśmy wśród genów, które są ważne w organizmie do pobudzania komórek, sprawdzając, czy takie geny mogą być aktywowane w mózgu w wyniku uczenia się i takim genem okazał się gen kodujący c-fos.

Białko c-fos, produkt ekspresji genu o takiej samej nazwie, jest białkiem jądrowym, zaangażowanym w regulację transkrypcji innych genów. Czy udało się państwu zidentyfikować jakie geny są regulowane przez to białko?

W końcu lat 90 odkryliśmy i opisaliśmy, że jednym z genów, którego transkrypcja regulowana jest przez białko c-fos jest gen, który koduje tkankowy inhibitor metaloproteaz (TIMP-1 ang. tissue inhibitory of matrix metaloproteinanses one). Udowodniliśmy, że białko TIMP-1, będące inhibitorem m.in. metaloproteazy-9 (MMP-9, ang. metaloproteinase 9) ma związek z uczeniem się.

Najczęściej metaloproteza-9 kojarzy się z przerzutowaniem nowotworów,
a państwo udowodnili funkcjonowanie tego enzymu w komórkach nerwowych?

Stwierdzenie, że białko to jest obecne w komórkach nerwowych, a jego ilość jest zależna od stanu pobudzenia komórek nerwowych było naszym fundamentalnym odkryciem. Wykazaliśmy, że białko MMP-9 może być lokalne wytwarzane i wydzielane na synapsach, a ponadto pokazaliśmy, że jego ekspresja jest regulowana przez c-fos. Z danych literaturowych wiadomo, że białka macierzy zewnątrzkomórkowej są wydzielane na zewnątrz komórki i działają jak proteazy przycinające inne białka. W naszym przypadku stwierdzenie na zewnątrz komórki jest oznacza też "na zewnątrz synapsy". Okazało, się bowiem że mRNA dla MMP-9, może wędrować po wypustce komórki nerwowej spory kawałek od jądra i ciała komórki, dojść do synapsy i tam ulegać lokalnej translacji, czyli lokalnej produkcji na synapsie. Pragnę przypomnieć, że synapsy zostały podzielone na dwie podstawowe klasy, synapsy pobudzające i hamujące. Neuroprzekaźnikiem hamującym jest np. kwas γ-aminooctowy (GABA), a neuroprzekaźnikiem pobudzającym jest kwas glutaminowy (Glu). Synapsy pobudzające są to takie synapsy, na które działa kwas glutaminowy i które na swojej powierzchni posiadają wbudowane cząsteczki receptora dla kwasu glutaminowego. W naszych badaniach pokazaliśmy, że tam gdzie pobudzane są receptory dla kwasu glutaminowego, metaloproteaza-9 wydzielana jest na zewnątrz synapsy. Dodatkowo białko MMP-9 może być są lokalnie produkowane na synapsie z mRNA, które też tam jest. Udało nam się powiązać funkcję MMP-9 z synapsą pobudzającą i jej zmianami. W ostatnich publikacjach udowodniliśmy, że MMP-9 może modyfikować kształt i strukturę tej synapsy.

Czy w badaniach, które państwo prowadzą stosują państwo też organizmy transgeniczne?

Stworzyliśmy w naszym Instytucie Pracownię Zwierząt Transgenicznych. Obecnie nie jest to część laboratorium, którym kieruję ale niezależna pracownia, która prowadzi działalność usługową i można w tej pracowni takie transgeniczne zwierzęta zamówić. Pomocnym narzędziem do naszych badań było stworzenie transgenicznych szczurów, które mają podwyższony poziom MMP-9 w komórkach nerwowych. Było możliwe dzięki temu, że takie zwierzęta posiadają dodatkowy gen MMP-9, ale aktywowany przez obszar regulatorowy promotora dla synapsyny-1, białka swoistego wyłącznie dla neuronów.

Z badań podstawowych wynika, że MMP-9 jest potrzebne w procesie uczenia się, dlaczego?

Wyniki naszych eksperymentów przeprowadzonych, na myszach z uszkodzonym genem MMP-9 dowodzą, że myszy te uczą się gorzej. Przede wszystkim dlatego, że białko to jest wydzielane na synapsach, a tym samym  ma wpływ na przebudowę struktury synapsy, działając z zewnątrz komórki. Nie wiemy dokładnie jak to się dzieje. Ostatnio otrzymane przez nas wyniki dowodzą, że poprzez przebudowę synapsy, aktywność MMP-9 może skutkować większym nagromadzeniem się receptorów dla glutaminianu na jej części postsynaptycznej. Jeżeli tych receptorów jest dużo, to przekaźnictwa za pomocą glutaminianu jest bardziej efektywne, co oznacza, że łatwiej taką komórkę pobudzić do aktywności  czyli depolaryzować.

Czy możliwe jest przełożenie państwa jakże podstawowych badań, na korzyści które mogą być wykorzystane w medycynie?

W 2008, w pracy opublikowanej w Journal of Cell Biology, wykorzystując mysie i szczurze modele genetyczne pokazaliśmy, że brak MMP-9 upośledza epileptogenezę, czyli rozwój padaczki. Dowiedliśmy, że stworzone przez nas szczury z nadmiarem MMP-9 łatwiej rozwijają padaczkę co dowodzi, że MMP-9 może odgrywać rolę w jej rozwoju. Z kolei brak MMP-9 upośledza epileptogenezę. Obecny chcemy zweryfikować hipotezę to czy MMP-9 może mieć znaczenie w leczeniu padaczki u ludzi. Można zatem uznać, że nasze badania mają potencjał kliniczny. Wspólnie z grupa badawczą z Finlandii obserwujemy pacjentów z pourazowym uszkodzeniem mózgu, których kilkanaście procent rozwija padaczkę. Sądzimy, że MMP-9 może mieć udział w rozwoju padaczki. Jednym ze sposobów  weryfikacji tej hipotezy jest wykorzystanie faktu, iż gen kodujący MMP-9 występuje u ludzi w różnych wariantach polimorficznych genów. Na przykład, jest znany taki wariant (występujący u 25% osób) gdzie obserwowany jest wyższy poziom transkrypcji tego genu niż o pozostałych z nas, cechujących się wariantem odmiennym. Chcemy zatem sprawdzić, czy pacjenci ze zdiagnozowanym pourazowym uszkodzeniem mózgu, którzy mają wspomniany wcześniej polimorfizm, przekładający się na wzmożoną aktywność genu MMP-9, będą bardziej podatni na rozwój padaczki. Ponadto chcemy również rozważyć wątpliwość czy zapadalność na padaczkę i rozwój ogniska padaczkowego koreluje z poziomem MMP-9 we krwi obwodowej badanych pacjentów.

Czy jest szansa na to, że monitorowanie MMP-9 może stać się istotnym czynnikiem prognostycznym w schorzeniach neurodegeneracyjnych?

Nasza koleżanka w Belgii chce opracować nowe diagnostyczne podejście do wykrywania MMP-9 w mózgu za pomocą pozytonowej emisyjnej tomografii komputerowej (PET). Zamierza ona syntetyzować nowe związki chemiczne, które mogą łączyć się z MMP-9, dzięki czemu możliwe było wykrywanie tego enzymu w mózgu. Jest to rzecz jasna, powiązane z badaniami stosowanymi, na które skądinąd nie mogę znaleźć źródła finansowania. Wiele inhibitorów MMP-9 było już testowane w klinice w kontekście przerzutowania nowotworów. Niektóre z nich dobrnęły nawet do trzeciej fazy badań klinicznych. Jestem zainteresowany które z nich, powstrzymywałyby rozwój padaczki w różnych modelach badawczych. Jak dotąd, na poziomie badań podstawowym udowodniliśmy, że istnieje związek, między aktywnością MMP-9 i etiologią padaczki. Z kolei na poziomie badań stosowanych pojawiałaby się próba zidentyfikowania inhibitora, który powstrzymałby padaczkę.

Czy w swoich badaniach biorą państwo pod uwagę fakt, że zaburzenia ekspresji metaloproteazy-9 mogą mieć również znaczenie w patogenezie chorób psychicznych?

Wspólnie z kolegami psychiatrami m.in. z profesorem Januszem Rybakowskim z Poznania i Jerzym Samochowcem ze Szczecina, pokazaliśmy że polimorfizm genu MMP-9, o którym wcześniej mówiłem, jest w jakiś sposób zaangażowany w rozwój chorób psychicznych człowieka np. w schizofrenii, chorobie afektywnej dwubiegunowej czy uzależnieniu od alkoholu. Istotne jest również znaczenie MMP-9 w zespole łamliwego chromosomu X, który jest najczęstszym zaburzeniem umysłowym u ludzi i daje również objawy autystyczne. Dane literaturowe potwierdzają, że u myszy które są genetycznym modelem zespołu łamliwego chromosomu X, przy nadmiarze MMP-9 struktura synaps jest zaburzona. Ale jeżeliby podać takim transgenicznym organizmom minocyklinę (antybiotyk używany przeciwko trądzikowi u ludzi), to poziom MMP-9 spada. Ogólnie wiadomo, że dokscykliny hamują aktywność MMP-9, również na poziomie aktywności enzymatycznej. Sytuacja taka stabilizuje funkcjonowanie synapsy, a zatem zachowanie myszy wraca do normy. Takie wyniki eksperymentów, dały podstawy ku temu, że od 3 lat podejmowane są próby kliniczne u ludzi ze zdiagnozowanym zespołem łamliwego chromosomu X.

W chorobach autystycznych, jest mniej więcej 350 – 400 genów zmutowanych , które do tej pory wykryto i ponad połowa z nich dotyczy plastyczności synaptycznej. Metaloproteaza-9 jako białko macierzy zewnątrzkomórkowej jest silnie zaangażowane w plastyczność synaptyczną. Czy można podejrzewać, że jej aktywność polega na przecinaniu takiej białkowej dżungli w przestrzeni zewnątrzkomórkowej i sprzyja zmianom kształtu synapsy?

Obecnie wiemy, że MMP-9 tak nie działa, a efektywność tego enzymu jest niezwykle subtelna, ponieważ on tylko przycina białka, wycina peptyd, albo eksponuje na powierzchni białka taki jego fragment, który normalnie był gdzieś w środku ukryty. Konsekwencją takiego działania MMP-9 jest aktywacja określonych receptorów na błonie komórki. Moglibyśmy zatem mówić o trzecim wielkim systemie przekazywania sygnałów z zewnątrz do wnętrza komórki, poza już opisanymi neuroprzekaźnikami, reaktywnymi formami tlenu i azotu, czy o przekaźnictwie opierającym się o sterydy. Sądzę, że ten system przekaźniczy, oparty o proteazy zewnątrzkomórkowe będzie kluczowy w zrozumieniu i opanowaniu chorób psychicznych, czy też neurologicznych Jeżeli chodzi o farmakologię, system ten jest niezwykle ciekawy, ponieważ działa na zewnątrz komórki, a więc lek nie musi wnikać do wnętrza komórki. Dodatkowym atutem jest fakt, że system ten opiera się o enzymy, a znalezienie inhibitorów enzymów nie jest takie trudne. Metaloproteazy były eksploatowane w kontekście nowotworów i zjawiska przerzutowania, jednak nie doczekały się one szczęśliwego finału. Problem poprzednich badań był taki, że dotychczas stosowane inhibitory były niespecyficzne. Dzisiaj wiemy, że różne metaloproteazy, są wydzielane zarówno przez przerzutującą komórkę nowotworową, która chce się gdzieś przedrzeć. Wiemy o istotnej roli MMP-9 w sygnalingu komórkowym i wiemy, że podścielisko w którym taka komórka nowotworowa chce się zagnieździć też może się bronić produkując metaloproteazy.

Wydaje się, że hamowanie tych enzymów powinno być zatem niesłychanie precyzyjne, zarówno w danym miejscu i czasie?

Zdecydowanie tak; my jesteśmy skupieni na wycinku wiedzy dotyczącym MMP-9, czyli o tym co jest na synapsie. Jeżeli byśmy to zrozumieli i znaleźli inhibitory, możliwe byłoby nawet lokalne modulowanie aktywność tych enzymów. Ostatnio w pracy doświadczalnej, która powstała we współpracy z niemieckim zespołem badawczym pokazaliśmy, że mikro RNA kontrolują taką lokalną produkcję MMP-9. Można to sobie wyobrazić jako lokalne kontrolowanie MMP-9 na synapsach tylko w neuronach, na zewnątrz komórki, tylko poprzez lokalne mikroRNA, działające na lokalną translację.

Dziękujemy za rozmowę i życzymy dalszych sukcesów.

Rozmowę przeprowadziła dr Marzena Szwed, redaktor naukowy portalu Biotechnologia.pl