Celem w badaniach transkryptomicznych jest globalna analiza profilu ekspresji w danych warunkach doświadczalnych, na przykład w obecności danego czynnika chemicznego czy fizycznego. W efekcie wyłania się pulę genów o obniżonym bądź podwyższonym poziomie ekspresji w stosunku do warunków kontrolnych.
Obecnym złotym standardem, zarówno w badaniach mikrobiologicznych, jak i z użyciem wyższych organizmów, są specjalnie zaprojektowane mikromacierze ekspresyjne oraz, przeżywające obecnie swój złoty wiek, sekwencjonowanie RNA nowej generacji - w skrócie RNA-seq. W swoim założeniu, obie te metody wymagają:
- odpowiedniego przygotowania biblioteki cDNA,
- specjalnie dedykowanych odczynników oraz specjalistycznego sprzętu,
- specjalistycznego oprogramowania do odczytu i analizy dużej ilości danych (szczególnie NGS),
- relatywnie wysokich nakładów finansowych.
Szczególnie w przypadku RNA-seq koszt analizy (oczywiście w zależności od wielkości transkryptomu, ilości próbek i głębokości sekwencjonowania) to wciąż wydatek rzędu kilkudziesięciu, a nawet kilkuset tysięcy złotych. Analizy NGS wykonywane są często w drodze usługi, ponieważ nie wszystkie placówki naukowo-badawcze dysponują odpowiednim sprzętem. Z pewnością może stanowić to wyzwanie dla niejednego aplikanta starającego się o finansowanie badań. Czy istnieją inne, bardziej „przyziemne” metody globalnej analizy ekspresji? Z pomocą przychodzi literatura lat 90. XX wieku…
Systemy reporterowe
Bakteryjne systemy reporterowe wcale nie muszą być passé i wciąż znajdują uznanie w wielu laboratoriach. Metody te opierają się na transformacji bakterii z użyciem specyficznego wektora. Wektor ten zawiera:
- sekwencję transpozonu o przypadkowym miejscu integracji do chromosomu bakteryjnego,
- pozbawiony promotora gen reporterowy.
Po wprowadzeniu takiego wektora, w odpowiednich warunkach hodowli dochodzi do integracji opisanej kasety z chromosomem bakteryjnym na drodze przypadkowej mutagenezy transpozonowej. W miejscu wbudowania genu reporterowego dochodzi do powstania genu fuzyjnego. Po przeprowadzeniu mutagenezy selekcjonuje się całą bibliotekę mutantów insercyjnych, którą następnie poddaje się wybranym warunkom doświadczalnym. Jeśli powyżej miejsca insercji dochodzi do nadekspresji promotora bakteryjnego, gen reporterowy także ulega ekspresji i można zaobserwować określony fenotyp. Genem reporerowym może być np. lacZ (gen β-galaktozydazy), gusA (gen β-glukuronidazy) lub gfp. Przy pierwszych dwóch, po dodaniu substratu obserwuje się tworzenie barwnego produktu, zaś aktywne białko GFP pozwala na obserwacje w mikroskopie fluorescencyjnym. Poniższy schemat przedstawia przykładową procedurę zastosowania systemu Tn917-lacZ dedykowanego dla bakterii Gram-dodatnich (Camilli A et al. 1990):
Rys. M. Kossakowska-Zwierucho
W wyłonionym zestawie mutantów wykazujących ekspresję genu reporterowego, przeprowadza się następnie sekwencjonowanie i identyfikację regionów flankujących insert. Można to zrobić na dwa sposoby: poprzez izolację i klonowanie sekwencji flankujących bądź przez bezpośrednią amplifikację sekwencji z zastosowaniem nested-PCR. Wynik takiej analizy to wyłonienie zestawu genów ulegających nadekspresji w danych warunkach traktowania.
Zalety systemów reporterowych:
- możliwość samodzielnego wykonania w każdym laboratorium stosującym powszechne techniki biologii molekularnej,
- niższy koszt niż w przypadku zautomatyzowanych metod wysokoprzepustowych,
- otrzymanie stałej kolekcji mutantów insercyjnych.
Wady systemów reporterowych:
- czaso- i pracochłonność,
- niecałkowite pokrycie genomu (zależy od liczby mutantów),
- informacja jedynie o genach ulegających nadekspresji, brak informacji o obniżonym poziomie ekspresji.
Biorąc pod uwagę zalety i ograniczenia metody, należy dostosować ją odpowiednio do własnych oczekiwań i potrzeb badawczych. Dla bakterii Gram-dodatnich dedykowany jest wspomniany system Tn917-lacZ wykorzystujący plazmidy pLTV1 i pLTV3. Dla bakterii Gram-ujemnych dedykowany jest powszechnie znany wektor do mutagenezy transpozonowej Mini-Tn5, dodatkowo uzupełniony o takie geny reporterowe jak gusA czy gfp.
Przykładowa literatura:
C. Xi, M. Lambrecht, J. Vanderleyden, J. Michiels, Bi-functional gfp-and gusA-containing mini-Tn5 transposon derivatives for combined gene expression and bacterial localization studies. J. Microbiol. Methods. 35, 85–92 (1999).
A. Camilli, A. Portnoy, P. Youngman, Insertional mutagenesis of Listeria monocytogenes with a novel Tn917 derivative that allows direct cloning of DNA flanking transposon insertions. J Bacteriol. 172, 3738–3744 (1990).
K. C. Rice, Creation of Staphylococcal Mutant Libraries Using Transposon Tn917 (Springer New York, 2014; http://link.springer.com/10.1007/7651_2014_188), vol. 1373.
KOMENTARZE