Chromatografia żelowa (SEC)/Field-Flow Fractionation – separacja i wyznaczanie masy cząsteczkowej białek

Alternatywną, bardziej innowacyjną techniką, wykorzystywaną do separacji i charakterystyki białek, polimerów i nanocząstek, jest Field-Flow Fractionation. Analizatory FFF wyróżniają się niezwykle wysoką rozdzielczością, dzięki której umożliwiają separację białek, peptydów i polimerów od 103 do 1012 Da. W przeciwieństwie do chromatografii żelowej, cząstki rozdzielane są w otwartym kanale przepływu, bez obecności fazy stacjonarnej. W przypadku FFF, odwrotnie niż w GPC/SEC, duże cząstki trafiają na detektor jako ostatnie.

Istnieje kilka wariantów techniki FFF. Najbardziej popularny, Asymmetric Flow FFF (AF4), separuje, podobnie jak GPC/SEC, na podstawie średnicy hydrodynamicznej. Ze względu na brak fazy stacjonarnej, separacja ta jest delikatniejsza, co może mieć znaczenie w badaniach wrażliwych struktur białkowych. Możliwe jest także podłączenie do kanału separującego pola elektrycznego, dzięki czemu zyskujemy drugi czynnik separujący – ładunek powierzchniowy cząsteczki.

Zarówno GPC/SEC, jak i FFF mogą być wyposażone w szereg zaawansowanych detektorów. Każdy z nich daje określone informacje o próbce. Podstawowe detektory to RI i/lub UV, czyli detektory stężeniowe. Na ich podstawie można określić zawartość poszczególnych frakcji w próbce, ale nie dają one bezpośredniej informacji o masie cząsteczkowej. Można zdobyć taką informację, tworząc krzywą kalibracyjną, jednak uzyskana w ten sposób masa cząsteczkowa jest wartością względną, która może być obarczona dużym błędem. Dołączenie detektora statycznego rozpraszania światła (MALS lub RALS/LALS) pozwala uzyskać wartość bezwzględnej masy cząsteczkowej. Jeżeli dodatkowo do układu dołączymy detektor wiskozymetryczny, możemy wówczas uzyskać informacje na temat struktury przestrzennej, konformacji i wielkości cząsteczki.

Rys. 1. Chromatograf żelowy OMNISEC, detektor Viscotek SEC-MALS 20

Dynamiczne rozpraszanie światła (DLS) – charakterystyka rozkładu wielkości cząstek białek oraz stężenia próbki

Dynamiczne rozpraszanie światła (DLS) jest niezwykle popularną techniką, rutynowo wykorzystywaną w laboratoriach biologicznych do wykrywania agregatów w roztworach wielkocząsteczkowych, określania rozmiarów białek, kwasów nukleinowych i kompleksów lub monitorowania wiązania ligandów [1].

W trakcie pomiaru próbka oświetlana jest laserem, którego światło zostaje rozproszone na cząstkach poruszających się ruchami Browna (im mniejsze cząstki, tym szybkość ich drgań wyższa). Powoduje to zmiany intensywności światła w czasie, zależne od współczynnika dyfuzji cząstek w badanym roztworze. Wielkość cząstek wyznaczana jest z równania Stokesa-Einsteina.

Przykładem analizatora DLS, umożliwiającego oznaczenie stężenia cząstek, jest Zetasizer Ultra w wersji Red. Analizator, wykorzystując technikę MADLS (Multi-Angle Dynamic Light Scattering) jest w stanie wyznaczyć stężenie cząstek i molekuł o wielkości już od 1 nm zarówno w próbkach monodyspersyjnych, jak i polidyspersyjnych, a wszystko przy objętości próbki zaledwie 20 μl!

Rys. 2. Analizatory wielkości nanocząsteki potencjału zeta Zetasizer Advance

Elektroforetyczne rozpraszanie światła (ELS) – agregacja i mobilność elektroforetyczna białek

Wnikliwa charakterystyka agregacji i mobilności elektroforetycznej białek jest szczególnie istotna w procesie produkcji biofarmaceutyków. Z punktu widzenia immunogenności produktu niezwykle interesujące są agregaty o wielkości 100 nm-1 μm.

Parametrem, który w prosty sposób określa skłonność białek zdyspergowanych w roztworze do agregacji, jest potencjał zeta (potencjał elektrokinetyczny). Do jego pomiaru wykorzystuje się analizatory, pracujące na podstawie techniki elektroforetycznego rozpraszania światła (ELS).

Technika ELS działa w oparciu o zjawisko elektroforezy. Dyspersja cieczowa wprowadzana jest do kuwety zawierającej dwie elektrody. Do elektrod przykładane jest pole elektryczne, a cząsteczki lub molekuły, które mają ładunek netto, a ściślej mówiąc – potencjał zeta netto, będą migrować w kierunku przeciwnie naładowanej elektrody z prędkością, zwaną ruchliwością elektroforetyczną, która jest związana z ich potencjałem zeta [2].

Pomiar potencjału zeta, połączony z wyznaczaniem wielkości cząstek przy pomocy dynamicznego rozpraszania światła, w prosty sposób umożliwia określenie stanu agregacji białek i biofarmaceutyków.

Izotermiczna kalorymetria miareczkowa (ITC) – charakterystyka wiązań białek z innymi mikrocząsteczkami

Kalorymetria jest działem nauki, zajmującym się pomiarem przepływu ciepła. Technikami kalorymetrycznymi można badać dowolne molekularne reakcje, a cząsteczki nie muszą wykazywać żadnych szczególnych cech. Możliwość ta wynika z faktu, iż praktycznie wszystkie procesy chemiczne i fizyczne związane są ze zmianą energii wewnętrznej układu, która z kolei jest przyczyną występowania efektów cieplnych podczas przemian. ITC (Isothermal Titration Calorimetry) jest doskonałą techniką umożliwiającą badanie oddziaływań białek z innymi mikrocząsteczkami. Stosowana jest do analiz ilościowych interakcji między molekułami. Kalorymetria ITC jest techniką miareczkowania, gdzie pomiar realizowany jest przez dodawanie równych objętości titranta w określonych odstępach czasu do celki pomiarowej, w której znajduje się roztwór drugiego reagenta. Mierzone jest bezpośrednio ciepło uwalniane lub absorbowane w czasie tworzenia wiązania.

ITC jest jedyną metodą, która równocześnie ustala wszystkie parametry wiązania w pojedynczym eksperymencie. Nie wymaga żadnych modyfikacji reagentów, biorących udział w wiązaniu, niepotrzebne są żadne znaczniki fluorescencyjne czy immobilizacja – ITC mierzy powinowactwo reagentów w ich formach niezmodyfikowanych.

Informacje na temat przepływu ciepła podczas wiązania pozwalają na dokładne określenie parametrów, takich jak: stała wiązania (KD), stechiometria reakcji (n), zmiana entalpii (∆H) i entropii (ΔS). Umożliwia to utworzenie kompleksowego profilu termodynamicznego interakcji między molekułami. Technika ITC sięga dalej poza powinowactwo między reagentami i umożliwia poznanie mechanizmów, odpowiedzialnych za interakcje molekularne. Uzyskane wyniki są nieocenionym wsparciem, pozwalającym podjąć pewną decyzję w wyborze odpowiedniego związku poprzez głębsze zrozumienie tych oddziaływań.

ITC jest bardzo szeroko stosowane w odkrywaniu i rozwijaniu nowych leków, a w szczególności do:

* określenia powinowactwa reagentów,

* selekcji i wyboru potencjalnych związków leczniczych,

* pomiaru termodynamiki,

* opisu mechanizmu wiązania,

* potwierdzenia ilości miejsc wiążących w projektowaniu małocząsteczkowych leków,

* opisywania specyficzności i wyznaczania stechiometrii reakcji,

* badań nad kinetyką enzymatyczną.

Rys. 3. Izotermiczny kalorymetr miareczkujący MicroCal PEAQ-ITC

Różnicowa kalorymetria skaningowa (DSC) – charakterystyka stabilności termicznej białek

Jedną z podstawowych technik, wykorzystywanych w badaniach stabilności termicznej białek, jest różnicowa kalorymetria skaningowa DSC (Differential Scanning Calorimetry). DSC jest techniką analizy termicznej, bazującą na pomiarze zmian cieplnych w molekule, pojawiających się w trakcie kontrolowanego wzrostu lub spadku temperatury, umożliwiając badanie biomolekuły w formie natywnej.

Biomolekuła obecna w roztworze występuje w równowadze między jej formą natywną (zwiniętą) a zdenaturowaną (rozwiniętą). Technika ta pozwala na wyznaczenie temperatury przejścia fazowego (Tm), a także wartości innych parametrów termodynamicznych, takich jak pojemność cieplna w funkcji temperatury oraz jej różnicy dla białka występującego w formie natywnej i zdenaturowanej (ΔCp). Im wyższa temperatura przejścia fazowego, tym bardziej stabilna molekuła. Różnicowy kalorymetr skaningowy określa także entalpię (ΔH) rozwijania, która wywołana jest podgrzewaniem. DSC pomaga uzyskać informację o czynnikach, które przyczyniają się do zwijania i zmian stabilności natywnych biomolekuł, takich jak: interakcje hydrofobowe, wiązania wodorowe, konformacyjna entropia i wpływ środowiska.

Dokładność i wysoka jakość danych uzyskanych z wykorzystaniem techniki DSC odgrywają kluczową rolę w procesie tworzenia potencjalnych terapeutyków.

Makromolekuły i kompleksy wielkocząsteczkowe (>5000 daltonów), takie jak białka, kwasy nukleinowe czy tłuszcze, tworzą dobrze opisane struktury, które przechodzą zmiany konformacyjne pod wpływem temperatury. Zachodzące zmiany strukturalne powodują absorpcję ciepła, wywołaną przez zmianę i przeniesienie wiązań niekowalencyjnych. Skaningowe mikrokalorymetry różnicowe mierzą ilość absorbowanego ciepła.

Najczęstsze aplikacje to:

* selekcja najbardziej stabilnych związków w badaniach nad biofarmaceutykami,

* badanie interakcji z ligandami,

* szybka optymalizacja warunków oczyszczania i produkcji,

* szybkie określenie optymalnych warunków przechowywania dla preparatów ciekłych.

Rodzaj aplikacji i możliwości urządzenia są niezwykle szerokie. Czynnikiem ograniczającym jest tak naprawdę możliwość wprowadzenia próbki do celi oraz następnie bezproblemowego jej usunięcia. Urządzenie charakteryzuje się również bardzo wysoką czułością, co musi się wiązać z odpowiednim dobraniem parametrów eksperymentu, aby możliwe było zaobserwowanie i dobre przeanalizowanie wyników, które otrzymamy (granic temperaturowych skanu, szybkości skanowania itp.).

Mikroskopia sił atomowych (AFM) – badanie topografii powierzchni

Mikroskopy sił atomowych z powodzeniem wykorzystywane są w wielu zastosowaniach branży LifeScience. Urządzenia, działając w trybie sondy skanującej w trakcie kilkuminutowego pomiaru, dostarczają szczegółowe dane o próbce, bez uszkadzania jej. Mikroskopy AFM pozwalają zaoszczędzić czas potrzebny na przygotowania próbki, co w połączeniu z krótkim czasem pomiaru, doskonale sprawdza się jako uzupełnienie innych powszechnie stosowanych technik mikroskopowych, takich jak SEM lub TEM.

Rys. 4. Mikroskop sił atomowych Redux firmy ICSPI

Spektroskopia dichroizmu kołowego – charakterystyka struktur drugo- i trzeciorzędowych białek

Dichroizm kołowy jest to zjawisko, bazujące na różnicach w absorbcji przez substancję światła spolaryzowanego kołowo prawo- oraz lewoskrętnie. Światło spolaryzowane lewoskrętnie kołowo i prawoskrętnie kołowo reprezentuje dwa możliwe stany pędu fotonu, dlatego dichroizm kołowy jest również nazywany dichroizmem dla spinowego momentu pędu. Dichroizm kołowy jest przejawem aktywności optycznej. Objawia się ona w pasmach absorpcyjnych optycznie aktywnych cząsteczek chiralnych.

Próbkami, które można poddać analizom, mogą być nie tylko białka i peptydy (białka rekombinowane, białka fuzyjne, przeciwciała itd.), ale także kwasy nukleinowe, leki syntetyczne, hormony, barwniki czy kompleksy metaloorganiczne, a w zasadzie – związki posiadające centrum chiralności aktywne optycznie.

Dichroizm kołowy wykazywany jest przez cząsteczki biologiczne, ze względu na ich składowe prawo- i lewoskrętne. Ponadto struktura drugorzędowa również nadaje poszczególnym cząsteczkom wyraźne właściwości CD. W związku z tym, np. alfa-helisa białek czy podwójna helisa kwasów nukleinowych, mają charakterystyczne dla swych struktur widma CD. Zdolność do tworzenia reprezentatywnych widm strukturalnych czyni to zjawisko niezwykle użytecznym w metodach spektrofotometrycznych, bazujących na CD w celu charakteryzacji biomolekuł.

Analiza CD polega na wzbudzeniu badanej próbki liniowym światłem spolaryzowanym. Zjawisko CD skutkuje zmianą polaryzacji światła liniowego na eliptyczną. Powstałe światło spolaryzowane jest skierowane na próbkę i traktuje się je jako wektor elektryczny. Następnie prowadzi się pomiar różnicy w absorbancji między światłem spolaryzowanym lewoskrętnie oraz prawoskrętnie. Na podstawie analizy uzyskanego widma CD (Circular Dichroism) możliwe jest uzyskanie informacji o strukturze oraz stabilności badanych biomolekuł, a mianowicie – struktury drugo- oraz trzeciorzędowej, a także stabilności chemicznej i termicznej.

Rys. 5. Chirascan – analizator dichroizmu kołowego

SUPR – CM (Spectral Unmixing Plate Reader – Chemical melt)

Jednym z kluczowych narzędzi w badaniach biotechnologicznych oraz molekularnych jest znajomość stabilności białek, gdzie swoje zastosowanie znajduje aparat SUPR – CM. Połączenie dobrze ugruntowanej metody denaturacji chemicznej z wewnętrzną fluorescencją białka oferuje szeroką kompatybilność z buforami biologicznymi oraz szybkie określanie stabilności biopolimeru.

Stosowanie tradycyjnych technik pomiaru stabilności białek obciążone jest różnego rodzaju kosztami. SUPR – CM pozwala na uzyskanie dokładnych krzywych denaturacji przy zaledwie 0,375 μg białka, co umożliwia zmniejszenie kosztów materiałów eksploatacyjnych. Ponadto, dzięki możliwości skanowania 384-dołkowej płytki w 2,5 minuty, a także wbudowanemu oprogramowaniu do analizy danych, szybko i prosto uzyskiwane są kluczowe wyniki. Dodatkowym udogodnieniem jest także brak konieczności stosowania barwników czy znaczników, dzięki czemu eliminowany jest wpływ tychże związków na pomiar i strukturę białka.

Zastosowania urządzenia:

* optymalizacja formuły i buforów,

* charakteryzacja białek,

* profilowanie stabilności i badania przesiewowe,

* ocena podobieństwa,

* badania w warunkach przyspieszonego stresu i wymuszonej degradacji.

SUPR – DSF (Spectral Unmixing Plate Reader – Differential scanning fluorimetry)

SUPR – DSF jest rodzajem różnicowej fluorymetrii skaningowej, pozwalającym na wykonanie badania przesiewowego stabilności białka, przy jednoczesnym uproszczeniu procesu przygotowania próbki oraz analizy otrzymanych danych. Technika wykorzystuje fluorescencję wewnętrzną białek i detekcję pełnego widma, a precyzyjne komponenty optyczne zapewniają większą czułość. Jest to rozszerzenie możliwości techniki stosowanej w SUPR – CM, gdyż w tej konfiguracji możliwy jest zarówno pomiar stabilności chemicznej, jak i termicznej białek.

Zastosowania urządzenia:

* badanie i selekcja wariantów,

* optymalizacja formuły i buforów,

* charakterystyka białka,

* profilowanie stabilności,

* ocena podobieństwa,

* badania przyspieszonego stresu i wymuszonej degradacji,

* analiza zmian konformacyjnych, wywołanych wiązaniem,

* ocena modyfikacji po translacji.

W obu aparatach (CM oraz DSF) za wewnętrzną fluorescencję białek odpowiadają trzy reszty aminokwasowe o aromatycznych łańcuchach bocznych: fenyloalanina, tyrozyna i tryptofan. Z tych trzech reszt najważniejszą rolę odgrywa ta ostatnia, ponieważ jej widma wzbudzenia i emisji mają najdłuższą długość fali (w pobliżu zakresu UV) i najdłuższy czas życia. Cechy te upraszczają pomiary jej fluorescencji i pozwalają na jej selektywne wykrywanie.

Spektroskopia Ramana – monitorowanie i kontrola procesów upstream

Każdy specjalista, zajmujący się bioprocesami przemysłowymi, doskonale wie, jak trudnym zagadnieniem jest ich monitorowanie i kontrola, z jednej strony ze względu na ich skomplikowaną naturę, z drugiej – delikatną matrycę biologiczną. Ponadto należy w takim procesie ustalić, zwykle w fazie badań i rozwoju, ścisłe zakresy składników odżywczych i produktów ubocznych. Ma to na celu obniżenie ryzyka destabilizacji. Utrzymanie danych warunków jest możliwe, jedynie dzięki cyklicznym pomiarom. Monitorowanie parametrów za pomocą metod klasycznych (najczęściej laboratoryjnych) jest czasochłonne oraz kosztowne.

W celu usprawnienia kontroli bioprocesów, firma Tornado Spectral Systems Inc. zaprojektowała szereg rozwiązań, pozwalających na oznaczenie wielu składników jednocześnie, cyklicznie, in situ, bez pobierania próbek. Postawiono na urządzenia, wykorzystujące spektroskopię Ramana do ciągłych pomiarów widma matrycy biologicznej. Rozwiązanie jest bezpieczne i dokładne. Ponadto pozwala na pewny pomiar w środowisku wodnym, co jest częstym problemem układów spektroskopii oscylacyjnej, np. NIR. Urządzenia umożliwiają wprowadzanie zmian w procesie w czasie rzeczywistym, jeżeli jego warunki zaczną odbiegać od tych ustalonych.

Spektrometr Ramana, z pomocą wzbudzenia światłem laserowym i zjawiska tzw. nieelastycznego rozpraszania fotonów, identyfikuje związki chemiczne występujące w mieszaninie reakcyjnej. Spektrometr Ramana pozwala na identyfikację związków chemicznych, występujących w mieszaninie reakcyjnej, wykorzystując światło lasera jako źródło promieniowania wzbudzającego oraz zjawisko nieelastycznego rozpraszania fotonów. Analizatory, wykonując cykliczne pomiary, umożliwiają obserwacje zachodzącej w procesie przemiany, a przez to – precyzyjne określenie jej rozpoczęcia, zakończenia oraz szybkości.

Spektrometry Ramana mogą w przyszłości stanowić niezwykle istotną funkcję w produkcji biofarmaceutycznej, jaką jest kontrola nad procesem. Urządzenia mogą wspomagać przemysł na wielu etapach – od laboratoriów R&D w rozwoju procesu, przez proces powiększania skali, aż do kontroli produkcji. Urządzenie umożliwia długoterminowe oszczędności, zarówno w prowadzeniu samego procesu (redukcję czasu trwania szarż, stabilizację procesu okresowego lub ciągłego, zwiększenie ogólnej wydajności instalacji), jak również obniżeniu kosztów zużycia materiałów laboratoryjnych i uwolnieniu personelu od rutynowych działań kontroli procesu, na rzecz właściwej kontroli jakości produktu.