Aktywność proteazy HIV-1 jest niezbędna w procesie montowania podzespołów wirusa HIV-1 w jedną, „infekcyjną całość”. Enzym ten rozcina długi polipeptyd, zsyntetyzowany w zainfekowanej komórce, tworząc pule dojrzałych białek wirusa. Zatem, blokując centrum katalityczne tego enzymu uniemożliwiamy wytworzenie się funkcjonalnych podjednostek wirusa – nie powstaje dojrzała (infekcyjna) forma HIV-1. Ze względu na kluczową rolę proteazy HIV-1 w cyklu infekcyjnym, jako strategię walki z HIV-1 przyjęto hamowanie aktywności enzymu przez specyficzne inhibitory. Jednym ze skutecznych brokerów proteazy HIV-1 jest pepstatyna. Związek ten jest heksapeptydem (Iva-Val-Val-Sta-Ala-Sta) zawierającym dwie reszty niezwykłego aminokwasu – statyny (Sta, kwas 3S,4S-4-amino-3-hydroksy-6-metyloheptanowy). Pepstatyna jest inhibitorem proteaz aspartylowych, w tym proteazy HIV-1. Peptyd ten bardzo specyficznie wiąże się z centrum katalitycznym enzymu, stała dysocjacji rzędu 10^(-11). Opierając się na właściwościach pepstatyny, grupa kanadyjskich naukowców kierowana przez H.B. Kraatza wykorzystała ów inhibitor w opracowanym przez nich elektrochemicznym biosensorze proteazy HIV-1. W tym celu przygotowano specjalny biokonjugat, czyli połączenie pepstatyny z ferrocenem (ferrocen dodatkowo podstawiono specyficzną grupą tak aby bez trudu można było immobilizować biokonjugat na elektrodzie wykonanej ze złota: wiązania Au-S). Biokonjugat immobilizowano na elektrodzie drukowanej (SPE), złotej, która w układzie była anodą. Wskutek przyłożonego napięcia pomiędzy elektrodami, pod nieobecność proteazy HIV-1, na elektrodzie pracującej – anodzie (Au) zachodzi proces utleniania ferrocenu (Fc do Fc+) czemu towarzyszy ustalenie się natężenia na określonym poziomie (zależnym od stężenia stosowanego tu roztworu wodnego NaClO4). Kiedy natomiast w badanym analicie pojawia się białko enzymatyczne – proteaza HIV-1, wtedy centrum katalityczne enzymu wiąże immobilizowaną na anodzie pepstatynę oplatając jednocześnie centrum redoks ferrocenu i obniżając tym samym wydajność utleniania Fc do Fc+. Proces wiązania enzymu do inhibitora prowadzi więc do zmniejszenia wydajności utleniania na anodzie (elektrodzie złotej), co na wykresach woltametrii cyklicznej przejawia się jako przesunięcie w kierunku wyższego potencjału (mV) i jednocześnie zmniejszenie gęstości płynącego prądu (mikroA/cm2). Autorzy pracy stwierdzili liniowy wzrost napięcia i liniowy spadek natężenia prądu, w granicach stężenia białka, proteazy HIV-1: od 5 do 100 nM. Aby wykluczyć niespecyficzne wiązanie się innych enzymów, przeprowadzono również badanie kontrolne w układzie z pepsyną, enzymem należącym do tej samej klasy co proteaza HIV-1 – proteazy aspartylowe. Wykazano, że powyżej pH = 6 roztworu pepsyna nie oddziałuje z papstatyną (jednakże interakcje takie obserwowano w bardziej kwasowym środowisku). Porównując to z zakresem pH działania proteazy HIV-1, który mieści się w przedziale od 5,5 do 9 stwierdzono, że możliwe jest rozróżnienie pomiędzy sygnałem właściwym biosensora (pochodzącym od wiązania się proteazy HIV-1), a interakcjami niespecyficznymi w układzie. Pomysł bioiosensora elektrochemicznego, opartego na tego typu biokonjugatach jest niezwykle ważny ze względu na możliwość detekcji klinicznie istotnych białek, które nie posiadają aktywnych centrów redoks.


Chemical Communications 2007, 3829-3831