Terminem „kinom” określa się zestaw kinaz białkowych danego organizmu. W przypadku ludzi w skład „kinomu” wchodzi 518 kinaz których substratami są białka (kinazy białkowe). Enzymy te katalizują transfer terminalnej grupy fosforanowej od adenozynotrifosforanu (ATP) do reszt aminokwasowych (serynowych i/lub tyrozynowych) białka substratowego. Proces fosforylacji białka z użyciem kinaz tyrozynowych lub serynowo-treoninowych prowadzi do „aktywacji” białka, co przejawia się na kilka sposobów: zdolność interakcji z innymi białkami, zmianę lokalizacji, stabilności. W przyjętej koncepcji sygnalizacji w komórce głównym założeniem jest fosforylacja kaskadowa, w której kinazy białkowe odgrywają kluczową rolę. Enzymy te pełnią funkcje zarówno receptorowe – po związaniu ligandu ulegają autofosforylacji, co przekłada się na aktywacje białek przekazujących sygnał dalej (np. Ras), jak i tworzą elementy kaskady sygnału wewnątrz komórki (MAPKKK-MAPKK-MAPK). Kaskada fosforylacyjna warunkowana przez kinazy powoduje zmiany w ekspresji genów i aktywności białek, które skutkują kompleksowymi zmianami w zachowaniu się komórki np. jej proliferacje i różnicowanie. Dysfunkcja kinaz białkowych prowadzi do wielu stanów patofizjologicznych, takich jak różnego rodzaju stany zapalne, choroby układu immunologicznego i układu krążenia a nawet proces nowotworzenia. Z tego względu niezwykle ważną jest zdolność monitorowania aktywności kinaz białkowych w organizmie. Tradycyjną metodą stosowaną w tym celu jest pomiar aktywności enzymatycznej „in vitro” po wcześniejszej lizie komórek. Technika ta choć daje powtarzalne rezultaty to jednak wymusza zmianę naturalnego otoczenia białek enzymatycznych, co implikuje potrzebę stosowania kolejnych, nierealistycznych założeń. W tym kontekście naukowcy opracowali biosensor aktywności enzymatycznej kinaz białkowych, oparty na technice FRET. Metodami inżynierii genetycznej skonstruowano liniowy konstrukt DNA który składa się z czterech głównych elementów: sekwencja nukleotydowa białka CFP (ang. Cyan Fluorescent Protein), sekwencja domeny wiążącej ufosforylowane aminokwasy – PAABD (ang. Phosphoamino Acid Binding Domain), sekwencja domeny substratowej (SUB.) – fosforylowanej przez kinazę białkową, sekwencja białka YFP (ang. Yellow Fluorescent Protein). Wektor ekspresyjny niosący taką wstawkę, po wprowadzeniu do komórki ulega ekspresji do systemu reporterowego aktywności specyficznej kinazy, względem której została zaprojektowana domena substratowa. System reporterowy aktywności kinazy białkowej – biosensor kinazowy działa na zasadzie rezonansowego przenoszenia energii fluorescencji od wzbudzonego fluorochromu 1 (tu: CFP) do fluorochromu 2 (tu: YFP), podlegającego wzbudzeniu. Proces FRET (ang. Fluorescence Resonanse Energy Transfer) możliwy jest gdy obydwa fluorochromy znajdą się w odpowiedniej odległości od siebie (do 10 nm), i gdy pierwszy z fluorochromów naświetlany zostanie światłem o odpowiedniej długości fali (energii). Kiedy te warunki zostaną spełnione zajdzie następująca sekwencja zdarzeń: wzbudzenie fluorochromu 1 światłem o odpowiedniej energii; powrót fluorochromu 1 do stanu podstawowego związany z emisją światła o charakterystycznej długości fali; wzbudzenie fluorochromu 2 światłem emitowanym przez fluorochrom 1, powrót fluorochromu 2 do stanu podstawowego związany z emisją światła o charakterystycznej długości fali (innej niż w przypadku fluorochromu 1). W myśl tego procesu biosensor kinazowy generuje sygnał w chwili gdy jego domena substratowa (SUB) zostanie ufosforylowana przez konkretną kinazę komórkową, a jego domena o dużym powinowactwie do fosfoaminokwasów (PAABD) zwiąże ufosforylowaną domenę substratową. Aktywność kinazy białkowej doprowadza do zagięcia struktury liniowej systemu reporterowego (CFP-PAABD-SUB.-YFP) w wyniku czego fluorochromy CFP i YFP sytuują się na tyle blisko siebie, że możliwy jest rezonansowy transfer energii FRET pomiędzy nimi. Dwie skrajne odpowiedzi omawianego biosensora naświetlanego światłem wzbudzającym CFP (434 nm) to: światło cyjanowe 434 nm (brak aktywności kinazy) lub światło żółte 526 nm (silna aktywność kinazy). W praktyce stosunek barwy żółty/cyjan (od 0 do 1) jest miarą aktywności określonej kinazy białkowej w danym momencie, gdyż system ten umożliwia nam monitoring dynamicznych zmian białka zachodzących „in vivo”. Największą zaletą biosensora jest jego szeroka stosowalność: pomiary aktywności kinaz białkowych na każdym poziomie komórkowym, zastosowanie w badaniach nad nowymi lekami (poszukiwania ligandu odwracającego dysfunkcję kinazy w konkretnym schorzeniu).


Źródło: Molecular BioSystems 2007, 3: 759-765