Biotechnologia.pl
łączymy wszystkie strony biobiznesu
Bakteryjny biosensor umożliwiający "screening„ makrolidów
20.11.2007
Makrolidy to grupa antybiotyków wytwarzanych przez promieniowce. W budowie tych związków wyróżnia się charakterystyczny, duży pierścień laktonowy zawierający niewiele wiązań podwójnych, w którym brak atomów azotu. Pierścień laktonowy podstawiony jest resztami cukrowymi, z których jedna jest przeważnie aminocukrowa. Makrolidy to związki o istotnym znaczeniu farmakologicznym. Należą tutaj: antybiotyki przeciwbakteryjne (działające bakteriostatycznie na bakterie gramdodatnie; pierścień zbudowany z 12 lub 14 atomów, sprzężony z dwiema lub więcej resztami cukrowymi), makrolidy przeciwgrzybowe i przeciwpierwotniakowe (polieny, 26-członowy pierścień laktonowy z trzema do siedmiu sprzężonymi wiązaniami podwójnymi). Mechanizm działania tych antybiotyków polega na hamowaniu syntezy białek poprzez odwracalne wiązanie się do podjednostki 50S rybosomu. Makrolidy wiążąc się do miejsca P podjednostki rybosomalnej (miejsce wiązania peptydylo-tRNA) hamują proces translokacji na rybosomie. Ze względu na znaczną strukturalną różnorodność makrolidów jak i ich szerokie zastosowanie (erytromycyna, azitromycyna, roksytromycyna, klarytromycyna, josamycyna, spiramycyna) w leczeniu wielu typów zakażeń, nieustannie poszukuje się nowych wysoce aktywnych postaci tej grupy antybiotyków („class-specific drug screening”). Niemieccy naukowcy stworzyli idealne narzędzie do tego celu. Opracowali komórkowy (bakteryjny) biosensor, który na obecność naturalnych bądź chemicznie zmodyfikowanych makrolidów reaguje bioluminescencją, niezależną od ich biologicznej aktywności. Metodami inżynierii genetycznej połączyli oni strukturalne geny lucyferazy pochodzące od Vibrio fischeri z operonem oporności na makrolidy mph(A) pochodzącym ze szczepu Tf481A E. coli. Operon ten składa się z trzech genów: mph(A), mrx, mphR(A). Pierwszy z nich koduje 2’-fosfotransferazę makrolidową, która inaktywuje antybiotyki tej klasy. Ekspresja operonu jest negatywnie regulowana na poziomie transkrypcyjnym przez białko represorowe mphR(A), które wiążąc się do promotora genu mph(A) uniemożliwia jego transkrypcje. Z koli w obecności erytromycyny (reprezentant klasy makrolidów 12-, 14-) transkrypcja tego genu jest na powrót aktywowana, co związane jest z odkształceniem konformacyjnym represora, po związaniu erytromycyny. Grupa badawcza kierowana przez G. Eberza wykorzystując jako komórkę-gospodarza szczep SM101 E. coli umieściła w niej, strukturalne geny operonu lucyferazy luxCDABE (od Vibrio fischeri) pod promotorem genu mph(A), jak również doprowadziła do nadekspresji genu represora mphR(A). Zasada działania skonstruowanego biosensora-komórki wygląda następująco: Pod nieobecność makrolidów system jest wyłączony – represor mphR(A) wiąże się do promotora mph(A), co hamuje ekspresje genów operonu i przejawia się brakiem bioluminescencji. Kiedy w środowisku pojawią się makrolidy, represor mphR(A) zmuszony jest oddysocjować od promotora mph(A) w wyniku czego dochodzi do ekspresji genów strukturalnych operonu luxCDABE (pozostających pod kontrolą promotora mph(A) właśnie). Ekspresja genów operonu, tzn. kolejno procesy transkrypcji i translacji prowadzą do powstania białka zwanego lucyferazą, czyli de facto enzymu-oksydazy, który utlenia lucyferynę do oksylucyferyny czemu towarzyszy świecenie (bioluminescencja). Naukowcy z Niemiec testowali opracowany biosensor na grupie makrolidów 12-, 14-, czyli związków o działaniu bakteriostatycznym. Należy zaznaczyć, że emisja światła nie była powiązana z antybiotykowym działaniem makrolidów lecz tylko z prostym faktem ich występowania. Zastosowanie operonu lucyferazy jako systemu reporterowego w biosensorze umożliwiło ekonomiczny (nie wymaga specjalnych substratów), łatwy, nieinwazyjny i szybki „screening” całkiem nowych, bądź chemicznie modyfikowanych makrolidów.


Analytical and Bioanalytical Chemistry
KOMENTARZE
news

<Lipiec 2024>

pnwtśrczptsbnd
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
1
2
3
4
Newsletter