Problem zakażeń krzyżowych linii komórkowych został po raz pierwszy nagłośniony w latach 60. XX w. przez dr Stanleya Gartlera, który wykazał w oparciu o badania ruchliwości izoenzymów w żelu elektroforetycznym, że wiele popularnych linii komórkowych to w rzeczywistości zakażenia komórkami HeLa. Podobnie było z pracami dr Waltera Nelson-Reesa, który w latach 70. i na początku 80. donosił o masowym problemie zakażenia linii komórkowych, wykorzystując metody analizy kariotypu. Jego prace spotkały się nie tylko z niedowierzaniem, ale wręcz wrogością środowiska naukowego.

W 2001 r. ukazała się praca prof. Johna Masters’a i wsp., jako pierwsza wskazująca profilowanie STR (ang. Short Tandem Repeat, krótkie powtórzenia tandemowe) jako międzynarodowy standard dla ludzkich linii komórkowych. Wskazano, że aż do 36% linii może być innego pochodzenia niż deklarowane. W 2007 r. prof. Roland Nardone w otwartym liście do amerykańskiego Departamentu Zdrowia wystąpił o to, aby czasopisma naukowe wymagały autentykacji linii komórkowych jako warunku publikacji, a instytucje przyznające fundusze na badania jako warunku przyznania grantu. W 2009 r. został powołany międzynarodowy zespół roboczy specjalistów z banków komórek i innych organizacji, kierowany przez ATCC Standard Development Organization, który miał za zadanie opracowanie standardu autentykacji ludzkich linii komórkowych w oparciu o metodę profilowania STR. Dokument ten, opublikowany w 2012 r. jako norma ANSI/ATCC ASN-0002-2011: Authentication of Human Cell Lines: Standardization of STR Profiling, określa najlepsze praktyki w zakresie autentykacji ludzkich linii komórkowych. W 2012 r., została utworzona grupa ICLAC (International Cell Line Authentication Committee, Międzynarodowy Komitet ds. Autentykacji Linii Komórkowych), w celu podnoszenia świadomości dotyczącej nieprawidłowej identyfikacji linii komórkowych oraz autentykacji linii jako skutecznych sposobów walki z tym problemem. ICLAC prowadzi bazę linii komórkowych, które są znanymi zakażeniami krzyżowymi lub zostały nieprawidłowo zidentyfikowane. Wymienia ona obecnie 488 nieprawidłowo zidentyfikowanych linii komórkowych. Na stronie ICLAC można też znaleźć wiele innych przydatnych informacji, m.in. zalecenia dla naukowców wprowadzających program autentykacji do codziennej praktyki, dotyczące takich etapów jak: planowanie projektu lub wniosku grantowego, rozpoczynanie pracy nad nowym projektem, wyprowadzanie nowych linii komórkowych, zamrażanie banków komórkowych czy testy na autentykację. Przydatna wydaje się też lista kontrolna dla naukowców piszących lub oceniających artykuły i wnioski grantowe, w których wykorzystuje się linie komórkowe. Obejmuje ona m.in. sprawdzenie czy linia nie znajduje się w bazie nieprawidłowo zidentyfikowanych linii, czy została przeprowadzona jej autentykacja oraz czy w artykule lub wniosku grantowym został udostępniony profil STR (dotyczy linii pochodzenia ludzkiego).

Ustalenie tożsamości ludzkiej linii komórkowej metodą profilowania STR jest obecnie kluczowym elementem w prowadzeniu wiarygodnych, powtarzalnych badań naukowych, w których wykorzystywane są ludzkie linie komórkowe.

Usługi profilowania STR
Kolekcja ATCC od wielu lat w ramach rutynowej kontroli jakości wykonuje profilowanie STR dla każdej serii ludzkiej linii komórkowej. Oferuje również wygodną i przystępną cenowo usługę profilowania STR.

Zestaw do przygotowania próbki posiada kod paskowy i jest prostym rozwiązaniem typu „all-in-one”, zawierającym wszystko, co jest potrzebne do izolacji, przechowywania i transportu komórkowego DNA do ATCC w celu analizy. Po otrzymaniu zestawu należy nanieść komórki na kartę FTA, zgodnie z dostarczoną instrukcją, wysuszyć je i wezwać wskazanego w instrukcji kuriera, który odbierze przesyłkę na koszt ATCC. Transport nie wymaga suchego lodu. Raporty są dostarczane mailowo w ciągu maksimum 5 dni roboczych od daty otrzymania próbek. Podpisany raport zawiera łatwą do zrozumienia tablicę z allelami STR, elektroferogramy z informacją o allelach dla każdego locus oraz obszerną interpretację wyników. Do sprawdzenia w ATCC można przesłać także ludzkie komórki z innych źródeł – profil próbki będzie porównany ze wszystkimi profilami referencyjnymi STR w bazie ATCC, a także z innymi bazami profili STR, jeśli będzie to konieczne. Wyniki są poufne. Do określania pokrewieństwa linii ATCC korzysta z wytycznych podanych w normie ASN-0002-2011. Linie komórkowe z co najmniej 80% zgodnością profili uznaje się za pokrewne, tzn. pochodzące od tego samego dawcy. Linie komórkowe ze zgodnością pomiędzy 56 i 79% wymagają dodatkowego profilowania do określenia pokrewieństwa.

Do autentykacji linii ATCC wykorzystuje zestaw PowerPlex® 18D firmy Promega, który pozwala na bezpośrednią amplifikację DNA z kart FTA, bez konieczności ich przemywania, co zwiększa prostotę i spójność obróbki próbek. System pozwala na jednoczesną amplifikację 18 loci, w tym podstawowych loci: D5S818, D13S317, D7S820, D16S539, vWA, TH01, TPOX i CSF1PO, które umożliwiają porównania zgodne z normą ASN-0002-2011. Allele w dodatkowych loci mogą być wykorzystane do monitoringu zmian przy kolejnych sprawdzianach, do porównania profili własnych próbek z upływem czasu.

Wymagania dotyczące autentykacji dla konkretnej publikacji lub wniosku o grant są określane przez czasopismo lub jednostkę finansującą. Najczęściej wymagany jest podpisany raport z profilem STR, pokazującym loci z liczbą powtórzeń w poszczególnych allelach z elektroferogramu. Profil ten określa „tożsamość” komórek. Zaletą podpisanego raportu ATCC jest to, że przygotowują go naukowcy w pełni przeszkoleni w zakresie analizy i raportowania surowych danych STR. Na stronie ATCC można pobrać przykładowy raport profilowania STR.

Podsumowanie
Wydaje się, że w projektach, w których wyniki w istotny sposób zależą od jakości hodowanych komórek, szczególnie istotne znaczenie ma zarówno pozyskiwanie komórek bezpośrednio z wiarygodnych źródeł, takich jak banki komórek stosujące odpowiednie procedury autentykacji, jak również regularne sprawdzanie komórek używanych w laboratorium. Zgodnie z dobrą praktyką laboratoryjną zaleca się autentykację komórek na początku i końcu projektu, a nie tylko po jego zakończeniu. Choć wymagania dotyczące grantów i publikacji mają znaczenie przede wszystkim dla środowiska akademickiego, również laboratoria badawcze firm biotechnologicznych i farmaceutycznych wdrażają programy regularnej autentykacji linii komórkowych, rozumiejąc, że nieprawidłowo zidentyfikowane linie mogą oznaczać znaczne straty finansowe.

Autor: Marek Primik, Specjalista ds. materiałów ATCC,

LGC Standards sp. z o.o.