Krótka charakterystyka plazmidów

Plazmidy są to autonomiczne pozachromosomalne elementy genetyczne występujące u wielu organizmów prokariotycznych i niektórych eukariotycznych. Występują w cytoplazmie, o wielkości najczęściej do 100 kbp (znane są również większe, tzw. megaplazmidy osiągające nawet 500 kbp). Występują one w wielu kopiach w komórce. Większość plazmidów zawiera region początku replikacji (ori), pozwalający im na niezależne namnażanie się w komórkach. Plazmidy występują zwykle w postaci superskręconej (CCC – DNA), mogą występować jako otwarta, kolista cząsteczka (OC – DNA) lub w postaci liniowej (L–DNA).Charakterystyczną ich cechą jest : fizyczna odrębność od chromosomu, zdolność do trwałego utrzymywania i replikowania się w komórce. Plazmid nie koduje funkcji, które byłyby konieczne do jej życia. Zwiększa natomiast różnorodność zajmowanych środowisk. Ilość genów zgromadzonych w plazmidach odgrywa znaczącą rolę w ewolucji i zdolności adaptacyjnych komórek, w których się znajdują.

Plazmidy zawierają zazwyczaj kilka genów, do których często zaliczamy geny oporności na antybiotyki. Klasyfikację plazmidów przeprowadzono w oparciu o to, jakie zawierają geny oraz o właściwości, jakie nadają komórkom gospodarza.

Typy plazmidów:

- plazmidy typu R – zawierają geny nadające bakterii oporność na antybiotyki (np. ampicylina).

- plazmidy typu F – umożliwiają przenoszenie genów między komórkami bakteryjnymi w procesie zwanym koniugacją.

- Plazmidy koli cynowe – w tych plazmidach zlokalizowane są geny kodujące białka zwane koli cynami, które zabijają inne bakterie.

- Plazmidy degradacyjne – kodują białka pozwalające komórce gospodarza metabolizować nietypowe związki, takie jak toluen czy kwas salicylowy.

- Plazmidy wirulencji – nadają bakteriom zdolność do wywołania chorób.

Wektorem posługujemy się w przypadku gdy chcemy wprowadzić fragment obcego DNA do komórki biorcy, celem uzyskania replikacji i/lub ekspresji, unikając przy tym jego degradacji .

Zapewnia powielanie wprowadzonego fragmentu DNA, czyli klonowanie a czasami także wydajną syntezę kodowanego przez gen białka (transkrypcję i translację oraz jego stabilność) jak to ma miejsce w tzw. wektorach ekspresyjnych. Najważniejszym elementem warunkującym specyficzność wektora są sekwencje odpowiedzialne za inicjację replikacji tzw. sekwencje ori. Najprostsze wektory posiadały wyłącznie jedno, unikalne miejsce restrykcyjne, w które można było wprowadzić obcy DNA. Obecnie najczęściej jest to tzw. polilinker - syntetyczny odcinek DNA, w którym znajduje się zwykle kilkanaście miejsc rozpoznawanych przez różne restryktazy.

Wektory zazwyczaj posiadają również geny markerowe (geny kodujące białka odpowiedzialne za łatwo wyróżnialne cechy fenotypowe).

Wymogiem konstrukcji wektora jest możliwość selekcji tych komórek, do których został wprowadzony. Jego budowa powinna pozwalać także na odróżnienie wektora zrekombinowanego od takiego, który zamknął się bez ligacji z fragmentem DNA..

Metody wykorzystywane w procesie transformacji :

- Metoda Chung’a i Miller’a – zaletą tej metody jest możliwość wcześniejszego przygotowania kompetentnych komórek, czyli zdolnych do przyjęcia egzogennego DNA i przechowywanie w dłuższym okresie czasu w głębokim zamrożeniu. W metodzie tej stosujemy glikol etylenowy (PEG 10% o stopniu polimeryzacji 3350, a czasami 6000 lub 8000), DMSO (sulfotlenek dimetylu), jony Mn²⁺ zawarte w buforze TSB oraz glukozę jako źródło węgla. Aby uniknąć szoku termicznego wszystkie czynności wykonujemy w lodzie. Ostatnim etapem jest przeszczepienie transformantów do świeżego podłożą i inkubacja w 37°C.

- Chang’a i Cohen’a – bakterie hodowane są do środkowej fazy logarytmicznego wzrostu, po czym odwirowane komórki zawiesza się w roztworze sacharozy z lizozymem. Po inkubacji powstają koliste formy – protoplasty, które są zabezpieczone przed pęknięciem dzięki obecności sacharozy. Następnie wprowadza się obcy DNA w określonej ilości, po czym zawiesinę przenosi się do glikolu polietylenowego PEG 6000. Przy braku zewnętrznej osłony obcy DNA może bez przeszkód wniknąć do środka. Po inkubacji protoplasty są rozsiewane na podłożą regeneracyjne, na których następuje odbudowanie osłon komórkowych, a następnie na podłoża selekcyjne.

- Metoda Mandel’a i Higa – badacze ci stwierdzili, że aby wywołać indukcję kompetencji należy inkubować w probówce komórki E. coli w roztworze chlorku wapnia we łaźni lodowej po czym dodać roztwór plazmidowego DNA. 50 molowy CaCl₂ powoduje rozluźnienie struktur komórkowych. Następnie przenosi się probówkę z łaźni lodowej do łaźni o temp. 42°C (3min) wywołując szok termiczny. W wyniku szoku najprawdopodobniej dzięki rozluźnieniu struktury osłon komórkowych następuje wniknięcie obcego DNA do wnętrza. Przeprowadzamy inkubacje w 37°C w środowisku bez antybiotyku (zaczynają działać nowe cechy wprowadzone z DNA plazmidowego). Rozsiewamy na stałe podłoże z dodatkiem antybiotyku i otrzymujemy transformanty. Inkubacja z CaCl₂ i szok termiczny sprawiają, że następuje rozluźnienie osłon komórkowych. Zjawisko to jest nazywane przejściem w stan kompetencji. W wyniku tej metody osiągamy wydajność transformacji 10⁶ jtk (cfu) z 1 mg DNA. Hanahan zmodyfikował tą metodę dodając oprócz CaCl₂, także jony magnezowe i manganowe, co zwiększyło wydajność do 10⁸jtk/ mg DNA.

- Metoda Anagnostopulos’a – polega na otrzymaniu kompetentnych komórek na drodze dwuetapowej hodowli na podłożach ubogich w składniki odżywcze. Powoduje to, że komórki nie wytwarzają do końca składników ściany komórkowej, co zwiększa ich przepuszczalność.

Replikacja typu toczącego się koła występuje często w przypadku różnych wirusów oraz niektórych plazmidów, a także podczas amplifikacji niektórych genów w komórkach zwierzęcych. Replikacja plazmidów kontrolowana jest przez dwa podstawowe mechanizmy: - pierwszy wykorzystuje powtórzone sekwencje zlokalizowane w okolicy punktu początkowego replikacji – iterony, które służą jako miejsca oddziaływania z białkami replikacyjnymi - drugi – czynnikiem jest cząsteczka RNA, która spełnia funkcję regulacyjną bezpośrednio łącząc się z komplementarnym transkryptem odpowiedzialnym za proces inicjacji replikacji lub wpływając na syntezę białka odpowiedzialnego za inicjację replikacji Mechanizmy te sa charakterystyczne głównie dla replikacji plazmidów o cząsteczkach kolistych, mechanizmy replikacji plazmidów liniowych są mniej poznane. W wielu plazmidach liniowyc replikacja przebiega z wykorzystaniem białek końcowych powiązanych z końcem 5’ każdej nici DNA Powielone w procesie replikacji plazmidy rozdzielane są w trakcie podziału komórki do komórek potomnych, tak aby każda komórka otrzymała co najmniej jedna cząsteczkę plazmidu. Proces rozdziału jest precyzyjnie regulowany, zapobiega to powstawaniu komórek bezplazmidowych.

Wydajność transformacji określa się jako ilość kolonii transformantów otrzymanych ( na podłożu selekcyjnym ) z 1 mg DNA użytego do transformacji; wydajność wyrażana jest w jtk/mg DNA.

Bibliografia:

Wacław Gajewski "Inżynieria genetyczna" PWN 1986

W. J. H. Kunicki – Goldfinger „Życie bakterii”

Jerzy Bal, „Biologia molekularna w medycynie. Elementy genetyki klinicznej” PWN 2007

P.C. Winter, G.I. Hickey, H.L. Fletcher,“Genetyka. Krótkie wykłady (wydanie II)”

http://www.bioleksykon.info

http ://aneksy.pwn.pl

red. Blanka Majda