Enzymy restrykcyjne (endonukleazy restrykcyjne) są enzymami tnącymi wiązania fosfodiestrowe w łańcuchu DNA. Izolowane są głownie z bakterii i sinic, rzadziej
z promieniowców. Ich biologiczna rola polega na rozcinaniu cząstek obcego DNA. Są one niezbędne w badaniu struktury chromosomów, sekwencjonowaniu bardzo długich cząsteczek DNA nadających się do klonowania. System ten składa się z dwóch elementów: pierwszym jest endonukleaza restrykcyjna, która rozpoznaje krótką, symetryczną sekwencję DNA
i przecina (hydrolizuje) szkielet każdej z nici DNA w specyficznym miejscu w obrębie tej sekwencji. Drugim elementem systemu jest metylaza, która dodaje grupę metylową do zasady C lub A w obrębie tej samej sekwencji komórkowego DNA. Ta modyfikacja sprawia, że DNA gospodarza staje się odporny na degradację. Komórkowy DNA nie ulega degradacji przez własne enzymy restrykcyjne, ponieważ miejsca przez nie rozpoznawane są w tym DNA zmetylowane.
Enzymy restrykcyjne możemy podzielić na:
- Enzymy klasy I – przecinają cząsteczkę DNA od wewnątrz,
nie rozpoznając określonych sekwencji. Nie posiadają zatem zdefiniowanych miejsc cięcia
i są mało specyficzne. Oprócz jonów Mg2+ wymagają do działania S-adenozynometioniny (SAM) oraz ATP.
- Enzymy klasy II - są zdolne do rozpoznawania specyficznych sekwencji
w DNA i przecinania dwuniciowej cząsteczki DNA w dwóch miejscach w obrębie tej sekwencji albo w dokładnie zdefiniowanym miejscu w pewnej odległości od niej. Do swego działania wymagają jonów Mg2+. Mają największe znaczenie praktyczne.
- Enzymy klasy III – rozpoznają określone sekwencje w DNA, ale miejsce cięcia nie jest dokładnie zdefiniowane. Wymagają ATP i jonów Mg2+ do działania.
Enzymy restrykcyjne mogą rozcinać DNA na dwa sposoby, pozostawiając dwa rodzaje końców:
- Tępe końce – powstają w wyniku nacięcia obu komplementarnych nici w tym samym miejscu.
5’–GGATATCC- 3’
3’–CCTATAGG- 5’
5’–GGAT-OH + P-ATCC- 3’
3’–CCTA-P + OH-TAGG- 5’
- Lepkie końce – są efektem nacięcia nici DNA w dwóch różnych miejscach oddalonych od siebie o kilka nukleotydów. Rozcięte w ten sposób nici DNA mają na końcach krótkie 1-niciowe fragmenty.
5’–GGATATCC- 3’
3’–CCTATAGG- 5’
5’–G-OH + P-GATATCC- 3’
3’–CCTATAG-P + OH-G- 5’
Wszystkie enzymy restrykcyjne pozostawiają grupę fosforanową na końcu 5', a grupę hydroksylową na końcu 3'. "Lepkie końce" mają duże znaczenie przy klonowaniu genów: sekwencje "lepkich końców" powstałych w wyniku działania tego samego enzymu są komplementarne. W obecności enzymu ligazy można takie cząsteczki ponownie połączyć ze sobą kowalencyjnie.
Inkubację preparatów DNA z enzymami restrykcyjnymi prowadzi się w temperaturze 37oC w czasie 1 godziny lub dłużej. Przerwanie reakcji (zwykle niekonieczne) można przeprowadzić przez termiczną inaktywację enzymu (15 minut, 65oC) lub dodając EDTA pH 8.0 do końcowego stężenia 10 mM (chelatacja jonów magnezu). Następnie do próby dodawany jest barwnik i próbkę nanosi się na żel agarozowy.
Fragmenty DNA powstałe w wyniku trawienia enzymami restrykcyjnymi dają się rozdzielić na żelach w taki sposób, że w każdym prążku na żelu znajdują się cząsteczki DNA o identycznej sekwencji nukleotydowej. Fakt ten pozwala na precyzyjną obróbkę DNA, m.in. konstruowanie map restrykcyjnych badanego DNA (mapa restrykcyjna wskazuje miejsca cięte przez enzymy restrykcyjne). Analizując na żelach produkty trawienia danego DNA różnymi enzymami restrykcyjnymi, stosowanymi pojedynczo i w kombinacjach, można ustalić wzajemne położenie i odległości pomiędzy sekwencjami rozpoznawanymi przez te enzymy. Oprócz tego, DNA pocięty enzymami restrykcyjnymi można poddawać ligacji
z wektorem i tworzyć zrekombinowane (zawierające sklonowany DNA) plazmidy.
Elektroforeza jest techniką badawczą polegającą na rozdziale obdarzonych ładunkiem cząsteczek takich jak: białka, kwasy nukleinowe pod wpływem pola elektrycznego. Cząsteczki kwasów nukleinowych umieszcza się na nośniku np. w żelu agarozowym lub poliakryloamidowym znajdującym się w polu elektrycznym. Dzięki zastosowaniu nośnika tworzy się swoistego rodzaju sieć (matryca) co znacznie zwiększa rozdział badanej próby. Ujemnie naładowane cząsteczki DNA przemieszczają się w kierunku dodatniej elektrody (katody), a szybkość ich ruchu zależy od długości fragmentów badanych kwasów nukleinowych. Dodatkowo żel chroni całość przed wpływem czynników zewnętrznych (np. temperaturą) stwarzając tym samym bardziej jednorodne warunki procesu. Szybkość migracji fragmentów badanego DNA (białka) jest odwrotnie proporcjonalna do ich wielkości. Forma superskręcona migruje w żelu najszybciej, następnie forma liniowa (przecięcie w obu niciach DNA), a najwolniej konformacja zrelaksowana. Dla żelów agarozowych stosujemy dość niskie napięcie rozdziału, które nie powinno przekraczać 5V na 1 cm odległości między elektrodami. W celu lepszej obserwacji postępu elektroforezy do badanej próby dodaje się również błękit bromofenolowy w 40% sacharozie. Sacharozę dodajemy by obciążyć próbkę, co ułatwia jej umieszczenie w studzience. Efekt elektroforezy możemy obserwować dzięki zjawisku fluorescencji bromku etydyny (EtBr). Związek ten interkaluje między wiązania wodorowe obecne w kwasie nukleinowym.
Nie trawiony enzymami restrykcyjnymi plazmidowy DNA podczas elektroforezy w żelu agarozowym rozdziela się przeważnie na dwa różne prążki: niższy, szybciej migrujący prążek, zawierający kolisty DNA o ujemnych superzwojach, wyizolowany z komórki w stanie nienaruszonym. Charakteryzuje się on dużą ruchliwością, wynikającą z jego bardzo zwartej konformacji. Wyższy prążek jest formą kolistą plazmidu, powstałą z formy superhelikalnej w wyniku pęknięcia jednej z nici. W związku ze swoją konformacją, charakteryzuje się on mniejszą ruchliwością elektroforetyczną.
Piśmiennictwo:
1. Lubert Stryer, John L.Tymoczko, Jeremy M. Berg "Biochemia" PWN 2007
2. Kofta Wawrzyniec „Podstawy inżynierii genetycznej” Prószyński i S-ka 2008
3. P.C. Winter, G.I. Hickey, H.L. Fletcher,“Genetyka. Krótkie wykłady (wydanie II)”
4. Jerzy Bal, „Biologia molekularna w medycynie” PWN 2007
5. Paweł Krzemień, „Real Time PCR w służbie diagnostyki wirusologicznej”
red. Blanka Majda
KOMENTARZE