Czym jest UPLC?

Ultrasprawna/ultraszybka chromatografia cieczowa UPLC (ang. Ultra-Performance Liquid Chromatography) została wprowadzona po raz pierwszy w 2004 roku. Aby wykorzystać cząstki o wielkości 2 µm, wymagane są wyższe ciśnienia. Typowy identyfikator kolumny UPLC to 2,1 mm. Szybkości przepływu są niższe niż HPLC, ale ze względu na wzrost wydajności całkowity czas oddzielania jest zmniejszony. Projektowanie i opracowywanie cząstek 2 μm stanowi spore wyzwanie, dlatego naukowcy od pewnego czasu aktywnie działają w tej dziedzinie, by móc wykorzystać zalety tej techniki. Na rynku są dostępne cząstki o wysokiej wydajności (o wielkości 1.5 μm), jednak mają one słabą ładowność i retencję z powodu małej powierzchni. Chcąc utrzymać retencję oraz pojemność podobną do HPLC, ultrasprawna chromatografia cieczowa wykorzystuje nową porowatą cząstkę, która może wytrzymać wysokie ciśnienia. Cząstki na bazie krzemionki posiadają dobrą wytrzymałość mechaniczną, jednak mogą mieć wady, takie jak ograniczony zakres pH oraz odprowadzanie podstawowych analitów. Kolumny polimerowe mogą przezwyciężyć ograniczenia związane z pH, ale idą za tym trudności związane niską efektywnością.

Czym jest UHPLC?

Wysokosprawna/wysokociśnieniowa chromatografia cieczowa UHPLC (ang. Ultra High Performance/Pressure Liquid Chromatography) jest jedną z wielu odmian chromatografii cieczowej, stosowaną przede wszystkim do analiz próbek zawierających nielotne, wielkocząsteczkowe związki chemiczne, głównie związki organiczne. Pierwszy komercyjny wysokosprawny chromatograf cieczowy powstał już w latach 60. ubiegłego wieku. Metoda ta pozwala na analizę znacznie większej ilości substancji w porównaniu do chromatografii gazowej. Skład fazy ciekłej oraz rodzaj fazy stacjonarnej jest uzależniony od składu badanych próbek i typu oddziaływań wykorzystywanych do rozdzielania analitów. Z reguły stosuje się mieszaninę acetonitrylu i wody. Dużymi atutami tej techniki są przede wszystkim: mniejszy rozmiar cząstek, znacznie szybsza analiza, a także wyższa rozdzielczość.

Zastosowanie

Techniki UPLC oraz UHPLC znalazły zastosowanie na wielu płaszczyznach, od prawnych, farmaceutycznych po medyczne. Systemy te są również ważnymi narzędziami w dziedzinie badań i produkcji. Bez UPLC i UHPLC naukowcy mieliby trudności z wykryciem obecności leków zwiększających wydajność w próbkach dostarczanych przez sportowców. Maszyny UHPLC wykorzystuje się do sprawdzania czystości produkowanych leków, a także w przemyśle spożywczym, m.in. do określania stężenia witamin w sokach. Stosowane są także do analizy składników związków, rozdzielaniu i identyfikacji aminokwasów, kwasów nukleinowych, białek, węglowodorów, pestycydów, węglowodanów, antybiotyków, steroidów i wielu innych substancji nieorganicznych. Metoda ta może być także wykorzystywana do ocenienia ilości analitów obecnych w próbce, a także przykładowego oznaczania czystości, zapewnienia jakości i kontroli badanego związku. Aparaty UHPLC są doskonałymi i prawie idealnymi do oznaczeń dodatków używanych w galwanotechnice. Co więcej, szybkość, rozdzielczość i czułość instrumentów UHPLC i UPLC sprawiają, że idealnie nadają się do stosowania ze spektrometrem masowym MS (ang. Mass Spectrometry). Przystępność i łatwość użycia nowej generacji instrumentów MS czyni spektrometrię mas sprzężoną z chromatografią cieczową (LC-MS) bardziej praktycznym dla większej liczby laboratoriów.

Zalety

Czas analizy zajmuje około 5 minut (kiedyś było to 45 minut), ze względu na zastosowanie krótkich kolumn (gdzie następuje rozdział badanych związków) oraz ich odpowiedniego wypełnienia o bardzo małych rozmiarach: 1.7 µm. Dzięki lepszemu rozdziałowi pików znacznie poprawiła się dokładność oznaczanych związków. Niewielkie rozmiary wypełnienia kolumn wymusiły zastosowanie dużych ciśnień – 1200 barów (w dawnych modelach HPLC ok. 400 barów). Podgrzewając kolumny UPLC do temperatury ~ 40 stopni C jesteśmy w stanie obniżyć lepkość roztworów. Umożliwia to zwiększenie prędkości przepływu badanej próbki przez układ oraz jednocześnie skraca czas analizy. Maksymalizacja ciśnienia, minimalne opóźnienie oraz szybkie nastrzyki umożliwiają uzyskanie bardzo szybkich czasów cyklu przy maksymalizacji wydajności pików. Co ważne, techniki te pozwalają na precyzyjne podawanie rozpuszczalnika, perfekcyjną powtarzalność i minimalne przenoszenie próbki.

Wady

Niestety, techniki te wymagają kilku poprawek, ze względu na niewielkie wady. Technika UHPLC uniemożliwia oddzielenie jonów nieorganicznych oraz polisacharydów. Dodatkowo agresywne, niepolarne rozpuszczalniki nie są kompatybilne z urządzeniem. Co najważniejsze, nie istnieje jeszcze idealny, uniwersalny wykrywacz.

Podsumowanie

Technologie te stanowią ważny krok naprzód. Dzięki lepszej rozdzielczości metody analityczne stają się bardziej udoskonalane, co sprawia, że nie jest wymagana ponowna analiza. Oczywiście, wciąż opracowywane są jeszcze szybsze i dokładniejsze technologie. Jednak ultrasprawna chromatografia cieczowa oraz wysokosprawna chromatografia cieczowa pozostają w czołówce wielu naukowych przedsięwzięć.