Elektroforeza kapilarna

Elektroforeza kapilarna to ogólne określenie zbioru technik elektromigracyjnych, do których należą: kapilarna elektroforeza strefowa, żelowa elektroforeza kapilarna, kapilarne ogniskowanie izoelektryczne oraz izotachoforeza kapilarna. Największe znaczenie ma pierwsza z wymienionych. Istota elektroforezy kapilarnej opiera się na odseparowaniu od siebie cząsteczek pod wpływem pola elektrycznego. Odbywa się to wewnątrz kapilary, w której umieszone jest ciekłe medium przewodzące. Zwykle jest nim woda. Pod wpływem przyłożonego napięcia elektrycznie naładowane cząsteczki lub całe grupy cząsteczek analizowanej próbki zaczynają przemieszczać się w różnych kierunkach i z różną prędkością. W ten sposób można je oddzielić od siebie oraz cząsteczek obojętnych. Do podstawowych zalet elektroforezy kapilarnej zaliczyć należy: niskie zużycie odczynników, bardzo wysoką sprawność, krótki czas analizy, możliwość jednoczesnego oznaczania kationów i anionów, wykonywanie analiz w szerokim zakresie pH czy generowanie małych ilości ścieków.

Poniżej przedstawiono i krótko scharakteryzowano najważniejsze techniki elektroforetyczne:

Kapilarna elektroforeza strefowa (CZE)

Jest to przykład najstarszej i najpowszechniej wykorzystywanej techniki elektroforetycznej. Kapilarna elektroforeza strefowa polega na rozdzielaniu jonów znajdujących się w buforze o ustalonej wartości pH (stały układ jonów). W takich warunkach, przy stałym natężeniu pola elektrycznego, jony wykazują różną ruchliwość. Proces rozdziału za pomocą CZE uzależniony jest od różnicy stosunku ładunku do masy badanych cząsteczek. Kapilarna elektroforeza strefowa jest techniką odpowiednią do separacji zarówno cząsteczek mało-, jak i wielkocząsteczkowych. Za pomocą CZE najczęściej analizuje się witaminy, węglowodany, peptydy, białka oraz kwasy organiczne.

Micelarna elektrokinetyczna chromatografia kapilarna (MEKC)

W przypadku tej techniki do buforu dodawane są związki powierzchniowo-czynne. Gdy ich stężenie w układzie przekracza krytyczne stężenie micelarne, tworzą micele. Czasami oprócz substancji powierzchniowo-czynnych do układu wprowadzane są także modyfikatory (np. cyklodekstryny). Zwiększają one zdolności rozdzielcze. Zasada rozdzielania w micelarnej elektrokinetycznej chromatografii kapilarnej polega na podziale składników próbki (elektrycznie obojętnych) pomiędzy bufor a micele. Te o charakterze hydrofobowym wnikają w micele i się w nich przemieszczają, natomiast te o charakterze hydrofilowym mają znacznie silniejsze powinowactwo do buforu. Składniki charakteryzujące się właściwościami pośrednimi – częściowo wnikają w micele, a częściowo pozostają w buforze. Zastosowanie MEKC ogranicza się głównie do analizy związków obojętnych (np. wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych), niektórych wielkocząsteczkowych (np. peptydów) oraz wybranych związków jonowych.

Izotachoforeza kapilarna (CITP)

W technice tej próbka umieszczana jest pomiędzy dwoma buforami – wiodącym i zakończającym. W trakcie analizy mogą być rozdzielane tylko jony o tym samym znaku. W zależności od tego, czy rozdzielane mają być aniony czy kationy, dobierane są właściwe bufory. Na przykład w przypadku anionów jako bufor wiodący stosuje się tak zwany katolit (aniony będące składnikami tego buforu mają większą ruchliwość niż aniony pochodzące z próbki), a bufor zakończający to anolit (jego aniony mają mniejszą ruchliwość niż aniony próbki). Analogicznie bufory dobiera się do analizy kationów. Przyłożenie napięcia stałoprądowego do buforów powoduje ruch jonów i ich separację w formie odrębnych stref. W wyniku rozdzielenia CITP otrzymywany jest izotachoferogram schodkowy. Technika ta nie jest odpowiednia do jednoczesnej separacji kationów i anionów. Stosowana jest do bezpośredniej analizy oraz wstępnego przygotowania próbki następnie analizowanej innymi technikami elektroforetycznymi. Wykorzystywana jest m.in. do zatężania wybranych składników.

Kapilarna elektroforeza żelowa

Wypełnienie kapilary w tym przypadku stanowi żel. Do najczęściej wykorzystywanych należy żel poliakryloamidowy. Zastosowanie w kapilarnej elektroforezie żelowej znalazły także: agaroza, dekstran oraz tlenek polietylenowy. Sieciowanie najpopularniejszego żelu poliakryloamidowego dobierane jest na podstawie wielkości molekuł, które mają zostać poddane rozdzieleniu. Odpowiednio przygotowane wypełnienie kapilary działa na zasadzie sita molekularnego. Aby zwiększyć trwałość żelu, można poddać go procesowi chemicznego wiązania ze ściankami kapilary. Żele mogą być także modyfikowane. Na mechanizm rozdzielania w kapilarnej elektroforezie żelowej składają się zjawiska elektroforetyczne, a także efekt sitowy. Rozdzielane składniki mieszaniny poruszają się wewnątrz kapilary z różną szybkością, zależną od ich wielkości – mniejsze cząsteczki poruszają się szybciej, a te o dużych rozmiarach znacznie wolniej. Kapilarna elektroforeza żelowa jest techniką wykorzystywaną przede wszystkim do oddzielania od siebie cząsteczek obdarzonych ładunkiem i znacznie różniących się między sobą rozmiarami. Stosowana jest m.in. do analizy fragmentów DNA.