Fot. Grzegorz Krzyżewski

Podążając tym tropem, naukowcy z Instytutu Chemii Fizycznej Polskiej Akademii Nauk w Warszawie (IChF PAN) i Narodowego Uniwersytetu Kaohsiung na Tajwanie przedstawili wyniki badań obejmujących opracowanie metody szybkiej i skutecznej diagnostyki przewlekłej śmiertelnej choroby – samoistnego zwłóknienia płuc. Samoistne zwłóknienie płuc (z ang. idiopatic pulmonary fibrosis, IPF) to przewlekła choroba, która wywołuje postępujące, nieodwracalne i śmiertelne w skutkach zwłóknienie płuc, prowadzące do uduszenia. Jej najczęstszymi objawami są suchy kaszel i duszności, które mogą być mylone z wieloma innymi zaburzeniami układu oddechowego. Przez to na trafnie postawioną diagnozę pacjenci oczekują nawet kilka lat, czemu nie tylko towarzyszy pogarszanie ich stanu zdrowia, ale i jakości życia. Co gorsza, objawy IPF mogą pojawić się dopiero wówczas, gdy na skuteczne leczenie pacjenta jest już za późno. Niestety, rozwój IPF to wciąż zagadka medyczna, stąd ogromna potrzeba jego wczesnego diagnozowania. Jednym z proponowanych sposobów diagnozowania IPF jest oznaczanie biomarkerów, tj. specyficznych związków, np. białek, kwasów nukleinowych lub innych, wytwarzanych przez organizm podczas rozwoju tej choroby. Znanych jest kilka biomarkerów IPF, a jednym z nich jest białko – metaloproteinaza macierzy-1 (MMP-1), które degraduje zwłókniony kolagen odkładający się w drogach oddechowych. Chociaż MMP-1 jest dobrze poznany, brakuje metod śledzenia jego stężenia w płynach ustrojowych podczas rozwoju IPF.

Niedawno naukowcy z Instytutu Chemii Fizycznej Polskiej Akademii Nauk w Warszawie, we współpracy z badaczami z Wydziału Inżynierii Chemicznej i Materiałowej Narodowego Uniwersytetu Kaohsiung na Tajwanie, opracowali nową, szybką metodę skutecznego oznaczania białkowego biomarkera MMP-1, w której zastosowali czujnik elektrochemiczny. Czujnik ten opracowali i wykonali z wykorzystaniem metody molekularnego wdrukowania w matrycę polimeru (z ang. molecularly imprinted polymer, MIP). Metoda ta obejmuje przygotowanie warstwy MIP-u za pomocą polimeryzacji z roztworu monomeru funkcyjnego i sieciującego w obecności wdrukowywanego związku chemicznego, który na tym etapie spełnia rolę szablonu. Następnie szablon ten usuwa się z MIP-u, w ten sposób tworząc w nim unikalne wnęki molekularne o kształcie i wielkości wdrukowywanych cząsteczek szablonu.

Do przygotowania czujnika badacze zmodyfikowali elektrodę w postaci płytki szklanej pokrytej przewodzącym tlenkiem indowo-cynowym (z ang. indium-tin oxide, ITO) za pomocą warstwy MIP-u na bazie poli(TPARA-co-EDOT), wykonanego z monomeru funkcyjnego TPARA i sieciującego EDOT. W MIP-ie tym wytworzono wnęki molekularne pasujące wielkością i kształtem do cząsteczek pepdytów znajdujących się na zewnątrz cząsteczki białka MMP-1, zwanych epitopami. Następnie wdrukowane cząsteczki epitopów zostały usunięte z MIP-u, pozostawiając wnęki o kształcie i wielkości charakterystycznej dla cząsteczek epitopów. Ponieważ wnęki w MIP-ie pasują tylko do tych cząsteczek, możliwe jest zastosowanie tego MIP-u jako elementu rozpoznającego w czujnikach do selektywnego oznaczania tychże epitopów, jak również całych cząsteczek MMP-1. Dopiero jednak domieszkowanie MIP-u płatkami disiarczku molibdenu (MoS2) znacząco podwyższyło granicę wykrywalności MMP-1 w porównaniu do niedomieszkowanego MIP-u. Dr hab. Piyush S. Sharma wyjaśnia: – Zastosowanie nowych materiałów rozpoznających anality w czujnikach elektrochemicznych może znacząco podwyższyć sprawność tych czujników i przyczynić się do wyjaśnienia mechanizmów wykrywania analitów. Podczas osadzania cienkiej warstwy MIP-u na elektrodzie ITO domieszkowaliśmy ją płatkami MoS2 o średnicy 0,6-1,5 μm. Domieszkowanie to przyczyniło się do dwukrotnego podwyższenia elektrochemicznego sygnału detekcji białkowego biomarkera MMP-1.

W makrocząsteczce białka MMP-1 kilka peptydów znajduje się na jej obrzeżach. Są to ww. epitopy, rozpoznawane przez nasz układ odpornościowy. Te epitopy mogą być z powodzeniem stosowane jako molekularne odciski w MIP-ie, a warstwa MIP-u – jako element selektywnego rozpoznawania czujnika. Dlaczego postawiono na peptydy? Otóż, wdrukowanie całych cząsteczek białek doprowadziłoby do wytworzenia dużych wnęk w MIP-ie. Wnęki te mogłyby również rozpoznawać cząsteczki mniejsze niż cząsteczki wdrukowanego białka, w ten sposób obniżając selektywność czujnika. Ponadto w określonych warunkach doświadczalnych, np. w obecności rozpuszczalników organicznych, zmian temperatury lub innych czynników chemicznych i fizycznych, na które narażone są szablony podczas tworzenia warstwy MIP-u na powierzchni elektrody, peptydy są trwalsze niż białka. Co więcej, zastosowanie płatków MoS2 podwyższa wykrywalność biomarkera MMP-1, co umożliwia jednoznaczne zdiagnozowanie IPF. – Sprawność elektrody pokrytej polimerem, molekularnie wdrukowanym epitopem peptydowym biomarkera MMP-1 i domieszkowanym płatkami MoS2, jest porównywalna, a nawet przewyższa sprawności opisane w ostatnich doniesieniach literaturowych. Wytworzoną elektrodę zastosowaliśmy do oznaczenia MMP-1 w pożywce hodowlanej genowo edytowanych komórek HEK293T. Okazało się, że dokładność tego oznaczania przewyższa dokładność oznaczania przeprowadzonego za pomocą handlowo dostępnego testu ELISA – zwraca uwagę prof. Włodzimierz Kutner.

Powyższe badania, szczegółowo opisane w czasopiśmie „ACS Applied Nano Materials”, są obiecujące i mogą umożliwić śledzenie przebiegu każdego kolejnego etapu przewlekłych i postępujących chorób o nieznanej etiologii i patogenezie, w tym samoistnego zwłóknienia płuc. Choć jest jeszcze wiele do zrobienia, jak chociażby badanie wpływu innych substancji obecnych w płynach ustrojowych na sprawność oznaczania MMP-1, z pewnością metoda wdrukowania molekularnego w matryce polimerowe jest na tyle atrakcyjna, że rychło znajdzie zastosowanie w biomedycynie, w szczególności diagnostyce wielu trudnych do leczenia chorób. Naukowcy mają nadzieję, że ich metoda oznaczania biomarkerów za pomocą czujników elektrochemicznych z polimerami wdrukowanymi molekularnie jako elementami rozpoznającymi znajdzie szerokie zastosowanie w diagnostyce innych chorób i przyczyni się do rozwoju medycyny spersonalizowanej. Ministerstwo Nauki i Technologii ROC dofinansowało niniejsze badania w ramach umów nr MOST 108-2923-B-390-001-MY3, MOST 109-2314-B-390-001-MY3, MOST 1102221-E-390-003-MY3 i MOST 111-2221-E-214-001-MY3, a Narodowe Centrum Badań i Rozwoju (NCBR) – w ramach grantu nr SensIPF PLTW/VI/2/2019.

Autorka: Dr Magdalena Osial, IChF PAN