Na czym polega lineage tracking?

Lineage tracking jest metodą umożliwiającą śledzenie potomstwa pochodzącego z jednej komórki. Komórka jest wyznakowana w taki sposób, że marker jest przekazywany potomstwu, a dzięki włączeniu sekwencji markera do genomu przekazywanie genu jest permanentne i nie ulega osłabieniu wraz z podziałami. Śledzenie dostarcza informacji o ilości komórek potomnych powstałych z jednej wyjściowej komórki, ich lokalizacji oraz różnicowaniu w przypadku komórek macierzystych.

Technika ta jest najczęściej wykorzystywana do śledzenia właściwości komórek macierzystych w dorosłych tkankach ssaków. Pomaga zrozumieć ścieżki rozwoju danej linii oraz rozpoznać pierwszą komórkę, w której wystąpiły jakieś patologie, choćby nieoczekiwana ilość podziałów prowadząca często do rozwoju nowotworu.

Warto dodać, że lineage tracking to nie tylko metody polegające na wbudowywaniu konkretnego markera w genom komórki. Również barwniki błon komórkowych, cytoplazmy czy jądra, pomimo że same w sobie są mało specyficzne, gdy zastosowane z odpowiedni sposób, mogą zastąpić śledzenie przy użyciu manipulacji genetycznych. Dzięki wynalezieniu barwników przyżyciowych, wybrana komórka może zostać wyznakowana poprzez wprowadzenie barwnika bezpośrednio do jej cytoplazmy, co umożliwia nam obserwacje jej dalszych losów.

Markery genetyczne

W metodzie lineage tracking najważniejsze jest, aby wprowadzony marker nie zmieniał właściwości komórki, jej potomstwa ani komórek sąsiadujących. Musi być stabilny i nietoksyczny dla komórki podczas całego procesu śledzenia.  Marker musi być przekazywany do wszystkich komórek potomnych, utrzymywać się w nich po czasie, natomiast nie może być przekazywany do komórek przyległych. Jeśli te zasady nie są zachowane, znakowanie może być niedokładne a otrzymane wyniki fałszywe, nie nadające się do interpretacji. 

Jednymi z często używanych markerów są białka fluorescencyjne jak GFP (ang. green fluorescent protein) lub enzym beta-galaktozydaza. Markery mogą być wprowadzane poprzez bezpośrednią iniekcję, transfekcję lub transdukcję, rzadziej stosowana jest lipofekcja i elektroporacja. Chętnie stosowana jest również metoda genetycznej rekombinacji przy użyciu enzymu rekombinazy. Najczęściej stosowanym systemem jest Cre-loxP, w którym rekombinaza znajduje się pod kontrolą tkankowo-specyficznego promotora u jednej linii. Ta linia jest krzyżowana z drugą, w której genom został wstawiony, fragment zawierający gen reporterowy otoczony przez sekwencję loxP-STOP-loxP. W zwierzętach, które w wyniku krzyżowania zawierają w swoim genomie oba konstrukty, rekombinaza Cre ulega ekspresji, wycina kodon stop znajdujący się pomiędzy fragmentami loxP, dzięki czemu możliwa jest ekspresja genu reporterowego.

Do czego stosowana jest ta metoda?

Początkowo technologia lineage tracking była wykorzystywana głównie w badaniach z zakresu biologii rozwoju. Naukowcy szybko dostrzegli potencjał, jaki w niej drzemie i dostosowywali ją do swoich potrzeb. Teraz lineage tracing wiedzie prym w badaniach nad komórkami macierzystymi, czynnikami warunkującymi ich różnicowanie oraz ich interakcje ze środowiskiem. Metoda ta znalazła też zastosowanie w onkologii, gdzie możemy badać jak komórka, o danej cesze (np. wyższa ekspresja białka adhezyjnego) radzi sobie w mikrośrodowisku nowotworowym, jak ta cecha wpływa na jej szybkość podziału oraz przetrwanie jej potomstwa.