Technika CITE-Seq łączy dane proteomiczne z transkryptomicznymi. Analizowane są białka powierzchniowe w sposób ilościowy i jakościowy przez korelację z wynikami sekwencjonowania RNA. Opisana ona została w roku 2017 w „New York Genome Center” (Satija Lab) [1]. Założenie metody jest następujące – białka zewnątrzkomórkowe są znakowane przez oligonukleotydy (w skrócie oligo) sprzężone z przeciwciałem (z ang. Antibody-Derived Tags, ADTs). W ten sposób na drodze specyficznego łączenia, a następnie sekwencjonowania biblioteki RNA (scRNA-Seq, z ang. single cell RNA sequencing) otrzymujemy dane charakteryzujące wspomniane białka. Stąd bardzo ważnym zagadnieniem jest projektowanie ADTs. Ich część oligonukleotydowa zawiera trzy ważne składowe opisane poniżej w kolejności od końca 3’:

* ogon poli(A) umożliwiający łączenie z fragmentami oligo(dT); jest to ważny element umożliwiający przygotowanie biblioteki mRNA, np. za pomocą techniki Drop-seq (z ang. Droplet Sequencing),

* barkodowany (z ang. barcoded) – fragment o sekwencji identyfikującej przeciwciało,

* fragment umożliwiajacy późniejszą specyficzną amplifikację metodą PCR.

Dodatkowo oligo na końcu 5’ jest skoniugowane z przeciwciałem poprzez kompleks biotyny i streptawidyny zawierające mostki dwusiarczkowe.

Etapy:

1. Dysocjacja tkanki – uzyskanie zawiesiny pojedynczych komórek.

2. Znakowanie – inkubacja zawiesiny z ADTs, płukanie z nadmiaru przeciwciała.

3. Drop-seq (jako metoda przygotowania biblioteki mRNA, jedna z wielu możliwych):

a) tworzenie mikroemulsji – przepuszczając oznakowaną zawiesinę w układzie mikroprzepływowym; na tym etapie zachodzi enkapsulacja pojedynczej komórki z cząstką magnetyczną w jednej kropli,

b) liza – w każdej kropli uwalniane są mRNA z komórki; w tych warunkach fragmenty oligonukleotydowe z ADTs są odcinane od przeciwciała poprzez redukcję wiązania dwusiarczkowego,

c) hybrydyzacja – oba rodzaje uzyskanych fragmentów nukleotydowych łączą się z oligo(dT), będących częścią kontruktów identyfikujących RNA, którymi są opłaszczone cząstki magnetyczne,

d) przeprowadzenie reakcji odwrotnej transkrypcji w celu otrzymania cDNA [2],

e) rozdział cDNA według długości – >300 bp (par zasad, z ang. base pair) pochodzące z mRNA, a fragmenty <300 bp jako pochodzące z ADTs,

f) amplifikacja – reakcja odwrotnej transkrypcji w celu otrzymania biblioteki mRNA.

4. Przed scRNA-Seq obie biblioteki są łączone w proporcjach zapewniających odpowiednią głębokość sekwencjonowania każdej z nich (np. 10% mRNA z ADTs i 90% mRNA z komórek).

5. Sekwencjonowanie biblioteki mRNA [1].

6. Analiza danych za pomocą różnych narzędzi bioinformatycznych. Otrzymane zestawienia są prezentowane za pomocą różnych metod statystycznych: analizy głównej składowej (z ang. principal component analysis, PCA), tSNE (z ang. t-distributed stochastic neighbor embedding), dwuwymiarowej mapy cieplnej (z ang. heatmap).

Zastosowanie

CITE-Seq pozwala zidentyfikować nowe typy komórek oraz opisać ich heterogenność. Dotyczy to przede wszystkim poznawania mechanizmów powstawania chorób i odkrycie nowych celów terapeutycznych. Metoda jest też używana do „śledzenia” kierunku różnicowania komórek macierzystych. Ma to zastosowania w medycynie regeneracyjnej i rozwoju terapii komórkowych.

Trudno jest opisać wszystkie odkrycia dokonane przy użyciu wspomnianej techniki sekwencjonowania, ale można naświetlić kilka przykładowych dziedzin:

* w kardiologii stwierdzono heterogenną populację makrofagów, która chroni przed zwłóknieniem mięśnia sercowego i stymuluje angiogenezę,

* w badaniach nad rakiem piersi skorelowano heterogeniczność komórek nowotworowych z ich danymi transkryptomicznymi, odnosząc to do odpowiedzi na leczenie,

* przez analizę komórek układu odpornościowego na drodze CITE-Seq wykazano kluczowe zmiany pomiędzy łagodną a umiarkowaną formą przebiegu choroby u pacjentów z COVID-19 [3].

Jak każda metoda badawcza, CITE-Seq ma szereg zalet, takich jak:

* wysoka przepustowość (co oznacza mniejszy koszt analizy, krótszy czas badania oraz więcej wyników z jednej analizy),

* dokładność wyników (porównywalna z immunofenotypowaniem wykonanym cytometrią przepływową),

* łączenie proteomiki z transkryptomiką w jednym eksperymencie.

Natomiast do ograniczeń metody należą:

* brak informacji o architekturze białek powierzchniowych (nie można stwierdzić, jak wygląda rozkład białek na powierzchni komórki),

* możliwość analizy tylko białek zewnątrzkomórkowych (wynika to z metodologii znakowania na powierzchni komórki) [1,3].

Na temat użyteczności metod różnego rodzaju sekwencjonowania amerykańska firma 10xGenomics (oferuje również narzędzia do CITE-Seq) podaje, że aktualnie w 7250 artykułach naukowych przeprowadzono analizy w oparciu o tę grupę metod badawczych, a w 2300 zarejestrowanych patentów użyto rozmaitych technik sekwencjonowania [4]. Imponujące dane wskazują na spory potencjał dalszego rozwoju wieloparametrowych metod analizy na poziomie pojedynczych komórek.