„Toksykometria jest działem toksykologii zajmującym się oceną toksyczności substancji chemicznym za pomocą różnych technik i metod badawczych. Wyniki badań toksykometrycznych pozwalają na dokonanie jakościowej i ilościowej oceny skutków działania czynników szkodliwych na organizm żywy w celu opracowania i wyznaczenia bezpiecznych poziomów narażenia dla ludzi mających kontakt z tymi substancjami i preparatami chemicznymi zarówno w środowisku zawodowym jak i pozazawodowym. Badania toksykometryczne prowadzone były dotychczas głównie na zwierzętach laboratoryjnych (myszy, szczury, chomiki, króliki, świnki morskie). W ostatnich latach coraz powszechniej stosowane są do tego celu testy in vitro, w których wykorzystuje się bakterie, grzyby, hodowle komórkowe lub tkankowe.
Metody badań toksyczności z podaniem zasad danego testu, liczbą i gatunkiem użytych zwierząt, warunkami przeprowadzenia testu, narażenia zwierząt i interpretacją wyników zostały opracowane i ujednolicone przez ekspertów OECD (Organization for Economic Cooperation and Development – Organizacja Współpracy Ekonomicznej i Rozwoju) i można je znaleźć na stronie internetowej tej Organizacji.”
- Zależność dawka-efekt.
- Zależność dawka-odpowiedź.
- Ocena toksyczności ostrej.
- Ocena miejscowego działania drażniącego na oko.
- Ocena działania uczulającego skórę
- Badania toksyczności krótkoterminowej, toksyczności podprzewlekłej i przewlekłej.
Toksykometria jest działem toksykologii zajmującym się oceną toksyczności substancji chemicznym za pomocą różnych technik i metod badawczych. Wyniki badań toksykometrycznych pozwalają na dokonanie jakościowej i ilościowej oceny skutków działania czynników szkodliwych na organizm żywy w celu opracowania i wyznaczenia bezpiecznych poziomów narażenia dla ludzi mających kontakt z tymi substancjami i preparatami chemicznymi zarówno w środowisku zawodowym jak i pozazawodowym. Badania toksykometryczne prowadzone były dotychczas głównie na zwierzętach laboratoryjnych (myszy, szczury, chomiki, króliki, świnki morskie). W ostatnich latach coraz powszechniej stosowane są do tego celu testy in vitro, w których wykorzystuje się bakterie, grzyby, hodowle komórkowe lub tkankowe.
Metody badań toksyczności z podaniem zasad danego testu, liczbą i gatunkiem użytych zwierząt, warunkami przeprowadzenia testu, narażenia zwierząt i interpretacją wyników zostały opracowane i ujednolicone przez ekspertów OECD (Organization for Economic Cooperation and Development – Organizacja Współpracy Ekonomicznej i Rozwoju) i można je znaleźć na stronie internetowej tej Organizacji.
Polska wersja metod badania toksyczności dostępna jest na stronach Biura do Spraw Substancji i Preparatów Chemicznych: www.chemikalia.gov.pl
Wystąpienie niekorzystnych skutków zdrowotnych w wyniku narażenia
na substancje chemiczne zależy od:
• zdolności substancji do wywołania uszkodzeń (skutków szkodliwych) w organizmach żywych
• od ilości substancji, która została podana lub wchłonięta do organizmu (dawki)
• drogi wchłaniania (układ oddechowy, skóra, układ pokarmowy,)
• rozłożenia dawki w czasie (zatrucie ostre, przewlekłe)
• czasu niezbędnego do wywołania danego uszkodzenia (efekty natychmiastowe i odległe)
• innych warunków (płeć, wiek, ogólny stan zdrowia i odżywiania oraz czynników zewnętrznych, jak temperatura i wilgotność powietrza)
Zależność dawka-efekt - związek między dawką substancji toksycznej a nasileniem efektu biologicznego u osobników lub w populacji. Efekty mogą być wyrażone liczbowo np. stężenie glukozy we krwi zwierząt narażonych na substancję w wybranej dawce w porównaniu ze stężeniem glukozy we krwi zwierząt narażonych na inną (mniejszą lub większą) dawkę.
Zależność dawka-efekt
Zależność dawka-odpowiedź – zależność między dawką danej substancji toksycznej a prawdopodobieństwem wystąpienia określonego efektu biologicznego w populacji narażonej
Zależność ta może być wyrażona tylko jakościowo i może nasilać się wraz ze wzrostem dawki, ale wyrażana jest nie dla poszczególnych osobników, ale dla całej grupy narażanej na wybraną dawkę.
Krzywa taka ma zwykle kształt litery S (sinusoidalny wzrastający) i ma górną i dolną asymptotę często równe 100% i 0%.
Istnieje zwykle mała dawka, na którą nie reaguje żaden osobnik i dawka duża, na którą reagują wszystkie osobniki.
Zależność dawka-odpowiedź
.jpg)
Generalnym celem badań toksykologicznych na zwierzętach jest ustalenie bezpiecznych poziomów narażenia ludzi na testowane substancje chemiczne. Wyznaczenie przewidywanych zależności dawka-efekt lub dawka-odpowiedź danej substancji chemicznej u ludzi w oparciu o wyniki badań doświadczalnych na zwierzętach nazywa się ekstrapolacją.
Dotyczy ona ekstrapolacji
• zależności dawka-efekt lub dawka-odpowiedź z jednego gatunku na drugi
• zakresu dawek (stężeń) na poziom ewentualnego narażenia ludzi
• częstości, rodzaju i nasilenia efektów toksycznych w niewielkiej grupie zwierząt na liczniejsze populacje ludzi
Postępowanie to jest konieczne, gdyż nie zawsze warunki narażenia są identyczne w jakich narażony jest człowiek, użyty gatunek zwierząt reaguje tak samo jak człowiek na działanie badanej substancji, a ponadto dawki (stężenia) stosowane w badaniach doświadczalnych na zwierzętach są prawie zawsze znacznie wyższe niż te na które narażony jest człowiek.
Ocena toksyczności ostrej
Ocena toksyczności ostrej ma na celu
• określenia stopnia toksyczności substancji chemicznych tj. zależności między dawką a skutkiem szkodliwym
• możliwości porównania toksyczności różnych substancji
• pozyskania informacji na temat swoistych skutków działania danej substancji
• pozyskania informacji na temat kierunku działania toksycznego testowanej substancji
Efekt ostry
Efekt działania substancji chemicznej w warunkach narażenia ostrego, tj. po jednorazowej dawce lub jednorazowym narażeniu inhalacyjnym, zwykle obserwowany do 14 dni
Wyznaczanie medialnych dawek i stężeń śmiertelnych
W celu ustalenia medialnej dawki/stężenia śmiertelnej (LD50/LC50) testowanej substancji, dla danego gatunku, zwierzęta narażane są jedną z poniżej wymienionych dróg:
inhalacyjne
dermalnie (przez skórę)
drogą pokarmową
Substancja testowana podawana jest w zróżnicowanych dawkach lub stężeniach (najczęściej ustalonych w postępie geometrycznym). Dawkę LD50 lub stężenie LC50 można wyznaczyć dla różnych gatunków zwierząt, w różnym wieku, różnej płci, narażanych różnymi drogami.
Medialna dawka śmiertelna/ medialne stężenie śmiertelne (LD50/LC50)
Statystycznie obliczona, na podstawie wyników badań doświadczalnych, ilość lub stężenie w medium środowiskowym, substancji chemicznej, która powoduje śmierć 50% organizmów badanych po jej podaniu w określony sposób.
W oparciu o wartości medialnych dawek/stężeń śmiertelnych substancje klasyfikuje się następująco:
Ocena miejscowego działania drażniącego na skórę
Efekty miejscowe
Efekt ograniczony do miejsca bezpośredniego kontaktu organizmu z substancją toksyczną
Substancja drażniąca
Czynnik chemiczny wywołujący stan zapalny w wyniku bezpośredniego, przedłużonego lub powtarzanego kontaktu ze skórą, błonami śluzowymi lub innymi tkankami
Badania działania drażniącego na skórę in vivo powinny być podejmowane
dopiero wówczas gdy:
• istnieją dostatecznie uzasadnione przesłanki wskazujące na potrzebę wykonania takiego badania
• analiza dostępnych danych nie pozwala na wyciągnięcie wniosków i przewidzenie skutków działania substancji w oparciu o pH substancji,
• analiza dostępnych danych nie pozwala na wyciągnięcie wniosków i przewidzenie skutków działania substancji w oparciu o wyniki badań substancji podobnych pod względem chemicznym,
• analiza dostępnych danych nie pozwala na wyciągnięcie wniosków i przewidzenie skutków działania substancji w oparciu o wyniki badań in vitro lub ex vivo
Substancja o działaniu drażniącym na skórę powoduje, w następstwie 4-godzinnej ekspozycji,
odwracalne uszkodzenie skóry
Substancja o działaniu żrącym na skórę powoduje nieodwracalne uszkodzenie skóry (martwica naskórka i skóry) w następstwie 4-godzinnej ekspozycji. Działanie żrące obejmuje owrzodzenia, tworzenie strupów, krwawienie, krwawe strupy, a po ich wygojeniu odbarwienia spowodowane łuszczeniem naskórka, z powstaniem blizn i całkowitym wyłysieniem
Ocena miejscowego działania drażniącego na oko
Biorąc pod uwagę zarówno przesłanki naukowe jak i dobro zwierząt, badanie działania drażniącego/żrącego in vivo na oko może być podejmowane gdy:
• istnieją dostatecznie uzasadnione przesłanki wskazujące na potrzebę wykonania takiego badania
• analiza dostępnych danych nie pozwala na wyciągnięcie wniosków i przewidzenie skutków działania substancji w oparciu o pH substancji,
• analiza dostępnych danych nie pozwala na wyciągnięcie wniosków i przewidzenie skutków działania substancji w oparciu o wyniki badań substancji podobnych pod względem chemicznym,
• analiza dostępnych danych nie pozwala na wyciągnięcie wniosków i przewidzenie skutków działania substancji w oparciu o wyniki badań in vitro lub ex vivo działania drażniącego/żrącego na skórę
Substancja o działaniu drażniącym na oko wywoduje zmiany całkowicie odwracalne w ciągu 21 dni, po aplikacji na przednią powierzchnię oka
Substancja o działaniu żrącym na oko powoduje nieodwracalne uszkodzenie oka lub poważną fizyczną utratę zdolności widzenia w następstwie aplikacji na przednią powierzchnię oka
Ocena działania uczulającego skórę
Badanie działania uczulającego na świnkach morskich wykonuje się dwuetapowo. W pierwszym etapie – indukcja uczulenia - wstrzykuje się śródskórnie w skórę grzbietu świnek morskich lub nanosi kilkakrotnie na jeden bok zwierzęcia, testowaną substancję (antygen), a następnie w drugim etapie badania (po około 2 tygodniach) wykonuje się test sprawdzający czyli wywołanie reakcji uczuleniowej. W tym celu na bok zwierzęcia aplikuje się badaną substancję i następnie, po usunięciu próbek testowanej substancji, ocenia reakcje skóry. Substancja będąca antygenem indukuje powstanie przeciwciał, które przy ponownym zetknięciu z tą substancją wyzwalają reakcję uczuleniową. Objawami wskazującymi na działanie uczulające są pokrzywka, różnego stopnia zaczerwienie i/lub obrzęk skóry w miejscu przyłożenia substancji w teście sprawdzającym.
Dla oceny wrażliwości na działanie uczulające przewidzianego do badań szczepu zwierząt oraz sprawdzenia poprawności metodyki badań, wykonuje się ocenę substancji o znanym działaniu uczulającym np. aldehyd α-heksylocynamonowy. Jeśli w badaniu tym u co najmniej 30% świnek morskich wystąpi pozytywna reakcja uczulająca na aldehyd α-heksylocynamonowy - można przyjąć, że zwierzęta danego szczepu są wystarczająco wrażliwe i mogą być użyte do oceny substancji o nieznanym działaniu uczulającym.
Badania toksyczności krótkoterminowej,
toksyczności podprzewlekłej i przewlekłej
Toksyczność krótkoterminowa
Badania mają na celu dostarczenie informacji pozwalających zaplanować badanie toksyczności podprzewlekłej i przewlekłej. Substancja testowana podawana jest zwierzętom w kilku dawkach przez 5 do 30 dni (zależnie od metody badania). Wyniki tych badań mogą dostarczyć informacji o ewentualnej kumulacji substancji, o możliwym jej działaniu układowym (np. nefrotoksycznym, hepatotoksycznym, neurotoksycznym).
Toksyczność podprzewlekła
Zdolność substancji chemicznej do wywołania efektu toksycznego w organizmach żywych podczas badania toksyczności podprzewlekłej.
Narażenie zwierząt trwa w tych badaniach najczęściej 90 dni, a ich zakres obejmuje ocenę integralnych wskaźników toksyczności (wygląd i zachowanie zwierząt, masa ciała, dobowe spożycie paszy i wody, względna i bezwzględna masa narządów wewnętrznych zwierząt sekcjonowanych), badania hematologiczne, biochemiczne krwi, badania moczu, ocenę patomorfologiczną narządów wewnętrznych zwierząt sekcjonowanych. Badanie pozwala na wykazanie czy substancja ma zdolność do kumulacji, czy ma działanie układowe i jakie ewentualnie są narządy/układy krytyczne.
Badanie 90-dniowe dostarcza informacji o możliwym zagrożeniu dla zdrowia wynikającym z przedłużonej ekspozycji obejmującej okres dojrzewania i wzrostu, aż do osiągnięcia dojrzałości. Badanie pozwala na oszacowanie najwyższej dawki lub poziomu ekspozycji przy którym nie obserwuje się działania szkodliwego wynikającego z podawania substancji testowanej (NOAEL). Metoda ta kładzie także nacisk na objawy neurologiczne oraz wskazuje efekty immunologiczne i reprodukcyjne, dając podstawę do dalszych badań w tym zakresie
Toksyczność przewlekła
Zdolność substancji chemicznej do wywołania efektu toksycznego w organizmach żywych w warunkach narażenia przewlekłego lub podczas badania toksyczności przewlekłej. Czas narażenia zwierząt wynosi najczęściej 12 lub 24 miesiące. Zakres badań jest szeroki i pozwala również na wskazanie działania rakotwórczego. Zakres badań obejmuje ocenę integralnych wskaźników toksyczności (wygląd i zachowanie zwierząt, masa ciała, dobowe spożycie paszy i wody, względna i bezwzględna masa narządów wewnętrznych zwierząt sekcjonowanych), badania hematologiczne, biochemiczne krwi, badania moczu, ocenę patomorfologiczną narządów wewnętrznych zwierząt sekcjonowanych. W planie badań przewiduje się prowadzenie oceny działania toksycznego po 6, 12 i 18 miesiącach narażenia zwierząt oraz oczywiście po zakończeniu 24 miesięcznej ekspozycji.
Badanie jest najwartościowsze, jeśli chodzi o ocenę skutków narażenia człowieka w środowisku zawodowym i pozazawodowym na badane substancje chemiczne.
no-observed effect level (NOEL) – najwyższy poziom narażenia (dawki), przy którym nie stwierdza się istotnego statystycznie lub biologicznie zwiększenia częstości jakichkolwiek efektów w grupie narażonej w porównaniu do grupy kontrolnej
lowest observed effect lovel (LOEL) – najniższy poziom narażenia (dawki), przy którym stwierdza się istotne statystycznie lub biologicznie zwiększenie częstości lub nasilenia efektów biologicznych narażenia o nieznanym znaczeniu toksykologicznym w grupie narażonej w porównaniu do kontroli
no-observed adverse effect level (NOAEL) – najwyższy poziom narażenia (dawki), przy którym nie stwierdza się istotnego statystycznie lub biologicznie zwiększenia częstości lub nasilenia efektów szkodliwych w grupie narażonej w porównaniu do grupy kontrolnej
lowest observed adverse effect level (LOAEL) – najniższy poziom narażenia (dawki), przy którym stwierdza się istotne statystycznie lub biologicznie zwiększenie częstości lub nasilenia efektów szkodliwych w grupie narażonej w porównaniu do grupy kontrolnej
Wytyczne OECD dotyczące metod oceny toksyczności substancji chemicznych można znaleźć na stronie http://www.oecd.org/env/testguidelines .
Wersja polska metod badania toksyczności znajduje się na stronach: www.chemikalia.gov.pl /Akty prawne > Polskie > Polskie - aktualne > Rozporządzenia.
Dr Krystyna Sitarek
Dr Krystyna Sitarek, Zakład Toksykologii i Kancerogenezy,
Instytut Medycyny Pracy im. prof. dra J. Nofera w Łodzi
KOMENTARZE