Promieniowanie UV negatywnie wpływa na powstawanie mutacji w mitochondrialnym DNA. Efekt ten jest spowodowany pośrednio przez powstawanie rodników OH, co opisuje poniższy artykuł. Artykuł opisuje także ochronny wpływ nanoemulsji, zawierających antyoksydanty, które neutralizują wolne rodniki.
Struktura i funkcje mitochondriów
Mitochondria są organellami odpowiedzialnymi za produkcje energii w procesie oddychania komórkowego. Glukoza i inne cząsteczki pochodzące z pożywienia ulegają w nich utlenieniu do dwutlenku węgla i wody. Energia uwolniona w tym procesie jest magazynowana w postaci trifosforanu adenozyny (ATP).
Mitochondria są otoczone przez podwójną błonę komórkową. Przestrzeń pomiędzy dwiema błonami jest oddzielona zarówno od środowiska poza komórkowego, jak i od wewnątrzmitochondrialnej matrix. Pirogronian powstający w wyniku glikolizy w cytozolu jest transportowany do wewnątrzmitochondrialnej matriks, gdzie włączany jest w Cykl Krebsa, którego produktem jest dwunukleotyd nikotyno-amido-adeninowy (NADH) i dwunukleotyd flawino-adeninowy (FADH2). Elektrony z NADH2 i FADH2 są przenoszone na tlen poprzez białkowe kompleksy na wewnętrznej błonie mitochondrialnej. Kompleksy te tworzą tzw. łańcuch oddechowy. Energia uwolniona podczas transportu elektronów umożliwia transport protonów (H+) przez kompleksy białkowe z matrix do przestrzeni międzybłonowej. Przepływ protonów w przeciwnym kierunku (do matrix), spowodowany powstałym gradientem stężeń jest wykorzystywany przez kompleks syntazy ATP do produkcji ATP.
Mitochondria zawierają własny DNA (mtDNA). Mitochondrialny DNA ma kolistą strukturę zawierającą 37 genów, utworzonych przez 16569 par zasad. 13 z tych genów koduje białka łańcucha oddechowego. Jednak każdy z kompleksów w wewnętrznej błonie mitochondrialnej zawiera podjednostki kodowane przez geny jądrowe, które są transportowane do mitochondriów po syntezie w cytozolu.
Wolne rodniki i metabolizm tlenowy
Proces fosforylacji oksydatywnej, podczas którego elektrony z NADH2 i FADH2 są transportowane na cząsteczkę tlenu generuje znaczne ilości wolnych rodników, mogących uszkodzić mitochondrialny DNA. Elektrony z NADH2 i FADH2 mogą reagować bezpośrednio z tlenem i tworzyć wolne rodniki w kilku punktach, podczas transportu elektronów wzdłuż białkowych kompleksów łańcucha oddechowego. Ze względu na brak histonów, pełniących ochronną rolę w mtDNA i mniej efektywne mechanizmy naprawcze niż w przypadku DNA jądrowego, mtDNA ulega znacznie częściej mutacjom. Częste mutacje zaburzają prawidłowe funkcjonowanie mitochondriów i prowadzą do obniżonej produkcji energii. Uszkodzony łańcuch oddechowy produkuje większą ilość wolnych rodników, które powodują uszkodzenia w całej komórce. Mutacje i delecje w mtDNA są uważane za główną przyczynę starzenia i chorób z nim związanych. Liczne badania wykazały zwiększoną ilość mutacji i delecji w mitochondriach pochodzących z różnych tkanek u osób starszych.
Koenzym Q10
Mitochondria zawierają enzymy, takie jak dysmutaza ponadtlenowa i katalaza oraz różne antyoksydanty, które umożliwiają oczyszczanie tych organelli z wolnych rodników. Jednym z antyoksydantów jest Koenzym Q10 (CoQ10), znany także jako ubichinon. CoQ10 jest lipofilną cząsteczką zawierającą quinon z izoprenowym łańcuchem bocznym. Ze względu na tłuszczowy charakter CoQ10 jest obecny w błonach komórkowych, szczególnie w wewnętrznej błonie mitochondrialnej, gdzie pełni kluczową rolę jako nośnik elektronów w łańcuchu oddechowym. Tam przenosi elektrony z 1 lub 2 kompleksu na kompleks 3, znany jako kompleks reduktazy koenzym Q-cytochrom c. Utleniona forma quinonu z koenzymu Q10, może przyjąć jeden elektron i utworzyć semi-quinone, a następnie drugi elektron wraz z dwoma protonami, tworząc w pełni zredukowaną formę dihydroquinonu (CoQ10H2).
W zredukowanej formie CoQ10H2 jest efektywnym, lipofilnym antyoksydantem. Wraz z witaminą E jest głównym antyoksydantem w błonach komórkowych. Mimo zdolności ludzkiego organizmu do syntezy CoQ10, jego niedobory występują bardzo powszechnie. Ponadto poziom CoQ10 zmniejsza się znacznie pod wpływem stresu i wraz z wiekiem. W przypadku niedoboru CoQ10 powinien być dostarczany w postaci suplementu w celu zapewnienia prawidłowego przebiegu procesów energetycznych i niezbędnej ochrony przed wolnymi rodnikami.
Mechanizmy przedwczesnego starzenia się skóry
Fakt udziału mutacji w mtDNA w przedwczesnym starzeniu się skóry jest dobrze udokumentowany. Badania wykazały, że w skórze narażonej na proces fotostarzenia liczba mutacji i delecji w mtDNA jest dziesięciokrotnie większa niż w skórze chronionej przed promieniowaniem słonecznym. Wielokrotna ekspozycja keratynocytów, fibroblastów lub ludzkiej skóry na fizjologiczne dawki promieniowania UVA prowadzi do powstawania mutacji w mtDNA. Analiza histologiczna skóry narażonej na fotostarzenie wykazała, obniżoną zawartość kolagenu i elastyny w matrix zewnątrzkomórkowej. Zredukowana produkcja włókien matrix zewnątrzkomórkowej może świadczyć o obniżonym metabolizmie keratynocytów i fibroblastów ze względu na niedobory w produkcji energii, związane z zaburzoną funkcją mitochondriów. Ekspozycja na promieniowanie UV powoduje zwiększoną produkcję wolnych rodników i prowadzi do mutacji i delecji w mtDNA. Powstałe wolne rodniki są zdolne do aktywacji metaloproteinaz znajdujących się w matrix zewnątrzkomórkowej, które odpowiadają za rozkład kolagenu i elastyny.
Badania nad indukcją mutacji w mtDNA fibroblastów przez promieniowanie UV
Podczas starzenia i chorób związanych z degeneracją mitochondriów wykryto zwiększoną częstość występowania delecji 4977pz w mtDNA. Delecja ta nazwana „częstą delecją” (ang. common deletion – Cdel) jest wykorzystywana jako marker mutacji i delecji w mtDNA.
W jednym z eksperymentów prowadzonych na ludzkich fibroblastach, autorzy zbadali poziom mutacji w mtDNA przed i po napromieniowaniu przez UVB. Eksperyment miał na celu zbadać ochronny wpływ nanoemulsji zawierającej 1% CoQ10 i 3% octanu witaminy E. Nanoemulsja zwierająca CoQ10 i octan witaminy E była stabilizowana przez lecytynę – wielkość cząsteczki wynosiła jedynie 50nm. Ze względu na wielkość cząsteczki Nanoemulsja jest przezroczysta i odpowiednia do badań z wykorzystaniem kultur komórkowych.
Częstość występowania Cdel w różnych ekstraktach z komórek została określona za pomocą reakcji Real-time PCR. Metoda ta jest zazwyczaj wykorzystywana do ilościowej analizy mRNA, ale może być także zastosowana do ilościowej oceny amplifikacji i delecji w DNA genomowym. Docelowy oligonukleotyd jest amplifikowany z wykorzystaniem dwóch starterów komplementarnych do końców oligonukleotydu. Fragment o długości 262pz znajdujący się poza sekwencją podlegającą delecji został wykorzystany do określenia całkowitego poziomu modna. W celu ilościowej oceny występowania Cdel wykorzystane zostały startery A i B, które są komplementarne wobec końców fragmentu o długości 470pz. Zawartość nieuszkodzonego DNA została określona przez amplifikacje fragmentu o długości 755pz przy pomocy starterów B i C.
Hodowla komórkowa ludzkich fibroblastów byłą prowadzona w standardowej pożywce wzrostowej aż do osiągnięcia konfluencji (*cała powierzchnia płytki pokryta komórkami). Po osiągnięciu konfluencji do medium dodana została nanoemulsja w stężeniu 0.4 i 2% na okres 72h. Następnie komórki były poddane promieniowaniu UVB (50mJ/cm2) 2 razy dziennie przez okres pięciu dni. Podczas naświetlania komórki były umieszczane w roztworze PBS, aby zapobiec powstawaniu fototoksycznych produktów. W okresie między naświetleniami komórki były umieszczone w standardowej pożywce wzrostowej, zawierającej nanoemulsje CoQ10. Po zakończeniu naświetlania komórki były inkubowane w pożywce wzrostowej, zawierającej nanoemulsje przez kolejne 72h. Izolacja całkowitego DNA i RT-PCR zostały wykonane zgodnie ze standardowymi protokołami.
Wielokrotne naświetlanie ludzkich fibroblastów, rosnących w standardowej pożywce wzrostowej bez dodatku nanoemulsji, subletalną dawką UVB spowodowało prawie 3-krotny (2.72) wzrost częstości występowania delecji Cdel. W obecności 2% nanoemulsji zawierającej CoQ10 poziom Cdel po naświetlaniu był zwiększony jedynie 1,58 raza w porównaniu z kontrolą.
Podobną zależność zaobserwowano w przypadku oznaczenia całkowitego poziomu mtDNA Naświetlanie spowodowało obniżenie całkowitego poziomu mtDNA o 35%. Fibroblasty inkubowane z nanoemulsją 2% i 0.4% wykazały obniżenie poziomu mtDNA, odpowiednio o 9% i 22% w wyniku naświetlania.
Ograniczeniem praktycznego zastosowania nanoemulsji może być problem jej transportu w głąb skóry i dostarczenia do głęboko położonych fibroblastów. Jednak produkty kosmetyczne są zazwyczaj stosowane 2 razy dziennie. W efekcie kilku tygodniowego stosowania dochodzi do akumulacji i aktywne składniki osiągają odpowiednie stężenie, także w głębokich partiach skóry.
Wyniki badania potwierdzają doniesienia o negatywnym wpływie promieniowania UV na powstawanie mutacji w DNA mitochondrialnym. Delecje wywołane przez promieniowanie UVB mogą być w znacznym stopniu ograniczone przez zastosowanie nanoemulsji, zawierającej CoQ10 i octan witaminy E o strukturze złożonej z ekstremalnie małych cząsteczek. Uzyskane wyniki wskazują, że szkodliwe efekty promieniowania UVB nie są spowodowane bezpośrednim wpływem na mitochondrialny DNA, ale są związane z powstawaniem rodników OH. Testowana nanoemulsja z CoQ10 i octanem witaminy E jest obiecującym składnikiem mogącym znaleźć zastosowanie w produktach kosmetycznych przeciwdziałających przedwczesnemu starzeniu się skóry.
Tłumaczenie z: Cosmetics & Toiletries Vol. 122 No 1/ January 2007
Źródło obrazka: PAP, Nauka w Polsce
Struktura i funkcje mitochondriów
Mitochondria są organellami odpowiedzialnymi za produkcje energii w procesie oddychania komórkowego. Glukoza i inne cząsteczki pochodzące z pożywienia ulegają w nich utlenieniu do dwutlenku węgla i wody. Energia uwolniona w tym procesie jest magazynowana w postaci trifosforanu adenozyny (ATP).
Mitochondria są otoczone przez podwójną błonę komórkową. Przestrzeń pomiędzy dwiema błonami jest oddzielona zarówno od środowiska poza komórkowego, jak i od wewnątrzmitochondrialnej matrix. Pirogronian powstający w wyniku glikolizy w cytozolu jest transportowany do wewnątrzmitochondrialnej matriks, gdzie włączany jest w Cykl Krebsa, którego produktem jest dwunukleotyd nikotyno-amido-adeninowy (NADH) i dwunukleotyd flawino-adeninowy (FADH2). Elektrony z NADH2 i FADH2 są przenoszone na tlen poprzez białkowe kompleksy na wewnętrznej błonie mitochondrialnej. Kompleksy te tworzą tzw. łańcuch oddechowy. Energia uwolniona podczas transportu elektronów umożliwia transport protonów (H+) przez kompleksy białkowe z matrix do przestrzeni międzybłonowej. Przepływ protonów w przeciwnym kierunku (do matrix), spowodowany powstałym gradientem stężeń jest wykorzystywany przez kompleks syntazy ATP do produkcji ATP.
Mitochondria zawierają własny DNA (mtDNA). Mitochondrialny DNA ma kolistą strukturę zawierającą 37 genów, utworzonych przez 16569 par zasad. 13 z tych genów koduje białka łańcucha oddechowego. Jednak każdy z kompleksów w wewnętrznej błonie mitochondrialnej zawiera podjednostki kodowane przez geny jądrowe, które są transportowane do mitochondriów po syntezie w cytozolu.
Wolne rodniki i metabolizm tlenowy
Proces fosforylacji oksydatywnej, podczas którego elektrony z NADH2 i FADH2 są transportowane na cząsteczkę tlenu generuje znaczne ilości wolnych rodników, mogących uszkodzić mitochondrialny DNA. Elektrony z NADH2 i FADH2 mogą reagować bezpośrednio z tlenem i tworzyć wolne rodniki w kilku punktach, podczas transportu elektronów wzdłuż białkowych kompleksów łańcucha oddechowego. Ze względu na brak histonów, pełniących ochronną rolę w mtDNA i mniej efektywne mechanizmy naprawcze niż w przypadku DNA jądrowego, mtDNA ulega znacznie częściej mutacjom. Częste mutacje zaburzają prawidłowe funkcjonowanie mitochondriów i prowadzą do obniżonej produkcji energii. Uszkodzony łańcuch oddechowy produkuje większą ilość wolnych rodników, które powodują uszkodzenia w całej komórce. Mutacje i delecje w mtDNA są uważane za główną przyczynę starzenia i chorób z nim związanych. Liczne badania wykazały zwiększoną ilość mutacji i delecji w mitochondriach pochodzących z różnych tkanek u osób starszych.
Koenzym Q10
Mitochondria zawierają enzymy, takie jak dysmutaza ponadtlenowa i katalaza oraz różne antyoksydanty, które umożliwiają oczyszczanie tych organelli z wolnych rodników. Jednym z antyoksydantów jest Koenzym Q10 (CoQ10), znany także jako ubichinon. CoQ10 jest lipofilną cząsteczką zawierającą quinon z izoprenowym łańcuchem bocznym. Ze względu na tłuszczowy charakter CoQ10 jest obecny w błonach komórkowych, szczególnie w wewnętrznej błonie mitochondrialnej, gdzie pełni kluczową rolę jako nośnik elektronów w łańcuchu oddechowym. Tam przenosi elektrony z 1 lub 2 kompleksu na kompleks 3, znany jako kompleks reduktazy koenzym Q-cytochrom c. Utleniona forma quinonu z koenzymu Q10, może przyjąć jeden elektron i utworzyć semi-quinone, a następnie drugi elektron wraz z dwoma protonami, tworząc w pełni zredukowaną formę dihydroquinonu (CoQ10H2).
W zredukowanej formie CoQ10H2 jest efektywnym, lipofilnym antyoksydantem. Wraz z witaminą E jest głównym antyoksydantem w błonach komórkowych. Mimo zdolności ludzkiego organizmu do syntezy CoQ10, jego niedobory występują bardzo powszechnie. Ponadto poziom CoQ10 zmniejsza się znacznie pod wpływem stresu i wraz z wiekiem. W przypadku niedoboru CoQ10 powinien być dostarczany w postaci suplementu w celu zapewnienia prawidłowego przebiegu procesów energetycznych i niezbędnej ochrony przed wolnymi rodnikami.
Mechanizmy przedwczesnego starzenia się skóry
Fakt udziału mutacji w mtDNA w przedwczesnym starzeniu się skóry jest dobrze udokumentowany. Badania wykazały, że w skórze narażonej na proces fotostarzenia liczba mutacji i delecji w mtDNA jest dziesięciokrotnie większa niż w skórze chronionej przed promieniowaniem słonecznym. Wielokrotna ekspozycja keratynocytów, fibroblastów lub ludzkiej skóry na fizjologiczne dawki promieniowania UVA prowadzi do powstawania mutacji w mtDNA. Analiza histologiczna skóry narażonej na fotostarzenie wykazała, obniżoną zawartość kolagenu i elastyny w matrix zewnątrzkomórkowej. Zredukowana produkcja włókien matrix zewnątrzkomórkowej może świadczyć o obniżonym metabolizmie keratynocytów i fibroblastów ze względu na niedobory w produkcji energii, związane z zaburzoną funkcją mitochondriów. Ekspozycja na promieniowanie UV powoduje zwiększoną produkcję wolnych rodników i prowadzi do mutacji i delecji w mtDNA. Powstałe wolne rodniki są zdolne do aktywacji metaloproteinaz znajdujących się w matrix zewnątrzkomórkowej, które odpowiadają za rozkład kolagenu i elastyny.
Badania nad indukcją mutacji w mtDNA fibroblastów przez promieniowanie UV
Podczas starzenia i chorób związanych z degeneracją mitochondriów wykryto zwiększoną częstość występowania delecji 4977pz w mtDNA. Delecja ta nazwana „częstą delecją” (ang. common deletion – Cdel) jest wykorzystywana jako marker mutacji i delecji w mtDNA.
W jednym z eksperymentów prowadzonych na ludzkich fibroblastach, autorzy zbadali poziom mutacji w mtDNA przed i po napromieniowaniu przez UVB. Eksperyment miał na celu zbadać ochronny wpływ nanoemulsji zawierającej 1% CoQ10 i 3% octanu witaminy E. Nanoemulsja zwierająca CoQ10 i octan witaminy E była stabilizowana przez lecytynę – wielkość cząsteczki wynosiła jedynie 50nm. Ze względu na wielkość cząsteczki Nanoemulsja jest przezroczysta i odpowiednia do badań z wykorzystaniem kultur komórkowych.
Częstość występowania Cdel w różnych ekstraktach z komórek została określona za pomocą reakcji Real-time PCR. Metoda ta jest zazwyczaj wykorzystywana do ilościowej analizy mRNA, ale może być także zastosowana do ilościowej oceny amplifikacji i delecji w DNA genomowym. Docelowy oligonukleotyd jest amplifikowany z wykorzystaniem dwóch starterów komplementarnych do końców oligonukleotydu. Fragment o długości 262pz znajdujący się poza sekwencją podlegającą delecji został wykorzystany do określenia całkowitego poziomu modna. W celu ilościowej oceny występowania Cdel wykorzystane zostały startery A i B, które są komplementarne wobec końców fragmentu o długości 470pz. Zawartość nieuszkodzonego DNA została określona przez amplifikacje fragmentu o długości 755pz przy pomocy starterów B i C.
Hodowla komórkowa ludzkich fibroblastów byłą prowadzona w standardowej pożywce wzrostowej aż do osiągnięcia konfluencji (*cała powierzchnia płytki pokryta komórkami). Po osiągnięciu konfluencji do medium dodana została nanoemulsja w stężeniu 0.4 i 2% na okres 72h. Następnie komórki były poddane promieniowaniu UVB (50mJ/cm2) 2 razy dziennie przez okres pięciu dni. Podczas naświetlania komórki były umieszczane w roztworze PBS, aby zapobiec powstawaniu fototoksycznych produktów. W okresie między naświetleniami komórki były umieszczone w standardowej pożywce wzrostowej, zawierającej nanoemulsje CoQ10. Po zakończeniu naświetlania komórki były inkubowane w pożywce wzrostowej, zawierającej nanoemulsje przez kolejne 72h. Izolacja całkowitego DNA i RT-PCR zostały wykonane zgodnie ze standardowymi protokołami.
Wielokrotne naświetlanie ludzkich fibroblastów, rosnących w standardowej pożywce wzrostowej bez dodatku nanoemulsji, subletalną dawką UVB spowodowało prawie 3-krotny (2.72) wzrost częstości występowania delecji Cdel. W obecności 2% nanoemulsji zawierającej CoQ10 poziom Cdel po naświetlaniu był zwiększony jedynie 1,58 raza w porównaniu z kontrolą.
Podobną zależność zaobserwowano w przypadku oznaczenia całkowitego poziomu mtDNA Naświetlanie spowodowało obniżenie całkowitego poziomu mtDNA o 35%. Fibroblasty inkubowane z nanoemulsją 2% i 0.4% wykazały obniżenie poziomu mtDNA, odpowiednio o 9% i 22% w wyniku naświetlania.
Ograniczeniem praktycznego zastosowania nanoemulsji może być problem jej transportu w głąb skóry i dostarczenia do głęboko położonych fibroblastów. Jednak produkty kosmetyczne są zazwyczaj stosowane 2 razy dziennie. W efekcie kilku tygodniowego stosowania dochodzi do akumulacji i aktywne składniki osiągają odpowiednie stężenie, także w głębokich partiach skóry.
Wyniki badania potwierdzają doniesienia o negatywnym wpływie promieniowania UV na powstawanie mutacji w DNA mitochondrialnym. Delecje wywołane przez promieniowanie UVB mogą być w znacznym stopniu ograniczone przez zastosowanie nanoemulsji, zawierającej CoQ10 i octan witaminy E o strukturze złożonej z ekstremalnie małych cząsteczek. Uzyskane wyniki wskazują, że szkodliwe efekty promieniowania UVB nie są spowodowane bezpośrednim wpływem na mitochondrialny DNA, ale są związane z powstawaniem rodników OH. Testowana nanoemulsja z CoQ10 i octanem witaminy E jest obiecującym składnikiem mogącym znaleźć zastosowanie w produktach kosmetycznych przeciwdziałających przedwczesnemu starzeniu się skóry.
Tłumaczenie z: Cosmetics & Toiletries Vol. 122 No 1/ January 2007
Źródło obrazka: PAP, Nauka w Polsce
Sylwia Tracichleb
KOMENTARZE