Terapia genowa polega na dodawaniu lub usuwaniu genów, a także na korygowaniu i wymianie istniejących genów wadliwych, odpowiedzialnych za rozwój choroby.

Metoda ta, opiera się na technikach molekularnych:

·         rekombinacji,

·         klonowania(dokładnego powielania materiału genetycznego),

·       transfekcji(wprowadzanie informacji genetycznej do komórki), hodowli kultur komórkowych i organizmów  transgenicznych

Bardziej konwencjonalnym zastosowaniem terapii genowej jest osiągnięcie zamierzonego efektu destrukcyjnego, np. poprzez autolizę komórek nowotworowych.

Terapię genową można przeprowadzić na całym organizmie pacjenta in vivo  wtedy gen znajduje odpowiednią komórkę docelową. Innym rodzajem jest terapia ex vivo - polega na pobraniu komórek od pacjenta i ich ponownym wprowadzeniu po zastosowaniu odpowiedniego genu.

W zależności od rodzaju komórek, w których jest stosowana, terapia genowa dzieli się na:

        Germinalna (embrionalna) terapia genowa

Dotyczy ona wprowadzania genów do komórek rozrodczych lub do zygoty tuż przed pierwszym podziałem. Tak wprowadzona zmiana jest dziedziczna tzn. przekazywana komórkom potomnym przy podziałach komórkowych. Całkowita eliminacja defektu genetycznego może nastąpić jedynie  w wyniku korekty błędu w łańcuchu DNA w komórkach rozrodczych, z których powstanie nowy organizm, lub we wczesnym okresie zarodkowym. Usuwanie defektu następuje w DNA wszystkich komórek organizmu i może być zgodnie z prawami dziedziczenia przekazywane następnym pokoleniom.

- Terapia kojarzona z manipulacjami – prawnie zakazana.

                Somatyczna terapia genowa

Polega na wprowadzeniu preparatu genowego do komórek somatycznych- komórek ciała (są nimi wszystkie typy komórek poza gametami). W tym przypadku wprowadzona zmiana nie jest dziedziczna, a leczenie ma charakter zachowawczy. Pierwotny defekt nie jest usuwany i mutacja odpowiedzialna za powstanie choroby pozostaje obecna w DNA wszystkich komórek chorego i może być zgodnie z prawami dziedziczenia przekazywana następnym pokoleniom.

-W somatycznej terapii genowej można uzyskać przywrócenie lub wzmocnienie (utraconej w pełni lub częściowo) funkcji zmutowanego genu.  Można również uzyskać supresję działania takiego genu, którego produkt, zmieniony w wyniku mutacji, jest odpowiedzialny za wystąpienie danej choroby. Pierwszą próbę somatycznej terapii genowej podjęto w 1980 roku. Leczenie tą drogą β-talasemii zakończyło się całkowitym niepowodzeniem!

-Rok 1990 podjęto terapię 4-letniej dziewczynki  z wrodzonym zespołem nabytego niedoboru odporności (SCID).

Stosowana jest głównie do leczenia chorób:

chromosomalnych, np. zespół Downa, jednogenowych, np. fenyloketonurii; niedoboru α1-antytrypsyny, hemofilii, galaktozemii, chorób wieloczynnikowych, np. nowotworów, chorób wieńcowo - naczyniowych

Jedną z najwcześniejszych była próba leczenia wrodzonego niedoboru deaminazy adenozynowej (adenosine dosaminase deficiency - ADA), choroby będącej ciężkim złożonym niedoborem odporności (severe combined immunodeficiency syndrom - SCID).

W większości badań, dotyczących terapii genowej, ‘normalny’ gen jest wprowadzany do genomu, w celu zastąpienia ‘nienormalnego’ genu, powodującego chorobę.  Cząsteczka będąca nośnikiem, nazywana jest wektorem.  Jest używana do dostarczania terapeutycznego genu do komórek docelowych pacjenta.  Obecnie, wektorem najczęściej jest wirus, który został genetycznie zmodyfikowany, tzn. zostały z niego usunięte geny odpowiedzialne za jego funkcje życiowe . Genetyczna modyfikacja nośnika , w tym wypadku wirusa, umożliwia przenoszenie ludzkiego DNA.

Komórki docelowe pacjenta, np. komórki wątroby, płuc są infekowane wektorem wirusowym.  Następnie wektor rozpakowuje swój materiał genetyczny do komórek docelowych, w którym to materiale znajduje się terapeutyczny gen. Funkcjonalne produkty terapeutycznego genu – białka przywracają komórkę do stanu normalnego.

Oto niektóre, z wielu rodzajów wirusów, stosowanych w terapii genowej:

*retrowirusy- mogą tworzyć dwuniciowe kopie DNA swoich genomów RNA. Te kopie mogą być wbudowywane w chromosomy komórek gospodarza.

*adenowirusy- posiadają dwuniciowy DNA. Powodują problemy układu oddechowego, pokarmowego.

*wirusy Herpes- posiadają dwuniciowe DNA, infekują określony typ komórek.

Poza systemem dostarczania genów za pomocą wirusów, znanych jest wiele metod bez udziału wektorów wirusowych. Najprostszą metodą jest bezpośrednie wprowadzenie terapeutycznego DNA do komórek docelowych. Takie zastosowanie jest jednak mocno ograniczone, ponieważ wymaga dużych ilości DNA i może być stosowane tylko w przypadku niektórych tkanek.

Inną nie wirusową metodą jest wytworzenie sztucznych lipidowych sfer z wodnym rdzeniem. Ten liposom, który niesie terapeutyczne DNA, jest zdolny przenieść je przez błony komórek docelowych.

Inną techniką, mającą potencjał, jest użycie komórek macierzystych w dostarczaniu genu. Są to niedojrzałe komórki, które mogą różnicować się albo dojrzewać , stając się komórkami o innych funkcjach. W tej technice, komórki macierzyste przygotowuje się w laboratorium, tak, by przyjęły nowy gen, który zmieni ich reakcję.  Na przykład gen wprowadzony do komórek macierzystych pozwoli im lepiej przetrwać chemioterapię.

W terapii genowej posługujemy się funkcjonalną postacią genu:

- Jest to pierwotny transkrypt pre-mRNA, który powstaje w wyniku działania polimerazy.

Sekwencje aminokwasowe białka, czyli sekwencje kodujące kodowane tylko przez egzony, które zajmują jedynie około 5% genu. Resztę genu stanowią introny- sekwencje wtrącone-interweniujące. Nie kodują one aminokwasów, jednak ich działanie nie zostało jeszcze do końca poznane. Ciekawym procesem jest składanie RNA, nazywane teżwycinaniem się intronów, splicingiem. Odbywa się on w jądrze komórkowym. Dopiero po tym procesie dojrzały transkrypt przechodzi do cytoplazmy.

Warianty terapii genowej:

Wybór docelowych komórek w terapii genowej, jak również wybór odpowiedniej metody leczenia zależy od typu schorzenia:

komplementacja genów: Do komórek z defektem genetycznym wprowadzana jest prawidłowa kopia genu, na podstawie której powstanie białko, którego wcześniejszy brak lub nieprawidłowe funkcjonowanie powodowało objawy choroby.

supresja genów: Zablokowanie działania genów na etapie transkrypcji(strategia antysensu), translacji(strategia tripleksu-antygenu)

eliminacja komórek: Do komórek docelowych wprowadzane są preparaty genowe zawierające cDNA kodujące białka wywołujące śmierć nieprawidłowych komórek.

nadanie komórkom cech fenotypowych: Przykładem jest terapia proangiogenna polegająca na podaniu preparatów genowych zawierających cDNA kodujące proangiogenne czynniki indukujące formowanie nowych naczyń krwionośnych

korekta mutacji: Metoda polega na naprawie defektu genetycznego (uszkodzony fragment genu lub cały gen zastępowany jest poprawną sekwencją). Najczęściej do tego celu wykorzystuje się oligonukleotydy lub rybozymy.

Aktywne cząsteczki kwasów nukleinowych:

Oligonukleotydy antysensowe –komplementarne do mRNA docelowego genu, hamującego jego ekspresję poprzez blokadę translacji

Oligonukleotydy antygenowe - tworzące trypleksy z dwuniciowym DNA i hamujące jego transkrypcję

Aptamery -oligonukleotydy silnie wiążące się z białkami, które wpływając na ich strukturę upośledzają biologiczne funkcje atakowanych cząsteczek

Rybozymy i DNAzymy -katalityczne kwasy nukleinowe posiadające zdolność sekwencyjnie specyficznej degradacji cząsteczek RNA

Krótkie interferujące RNA, siRNA - (ang. short interfering RNA). krótkie, dwuniciowe cząsteczki RNA, indukujące zjawisko interferencji RNA, odpowiedzialne za potranskrypcyjne wyciszanie ekspresji genów

Jak to działa?

Cząsteczka double stranded RNA jest hydrolizowana przez specyficzny enzym zwany Dicer, który wycina z niej krótkie (21-23 pz) dupleksy RNA -siRNA

Dupleks siRNA wiąże się z kompleksem białkowym RISC który rozplata dupleks siRNA, a następnie jego nić antysensowną i wykorzystuje do odnalezienia docelowej cząsteczki mRNA. Dzięki aktywności nukleazowej kompleks RISC hydrolizuje mRNA w środkowej części sekwencji zidentyfikowanej przez siRNA. Przecięta cząsteczka mRNA jest natychmiast degradowana w komórce, a co za tym idzie nie następuje synteza białka

Aptamery - Oligonukleotydowe ligandy doskonale dopasowane przestrzennie do cząsteczki białka. Cząsteczka takiego oligonukleotydu po związaniu z białkiem powoduje upośledzenie lub całkowitą utratę jego biologicznej funkcji.

Rybozymi i DNAzymy - Zarówno rybozymy, jak i DNAzymy hydrolizują wiązanie fosfodiestrowe ze sprawnością porównywalną do enzymów białkowych. Degradacja docelowego RNA jest sekwencyjnie specyficzna na zasadzie parowania zasad typu Watsona-Cricka pomiędzy odpowiednimi domenami rybozymu lub DNAzymu a cząsteczką docelową.

Terapia genowa budzi wiele kontrowersji, szczególnie jeśli mowa o ingerencji w komórki rozrodcze. Człowiek posiada biliony komórek, jednak bardzo niewielka ich część jest zaangażowana w procesy rozrodcze. Ingerencja w gen byłaby przekazywana kolejnym pokoleniom, dlatego ciągle jest to zabronione i budzi sprzeciw.

Piśmiennictwo:

1. 'Biochemia' L.Stryer PWN 2009

2. 'Biologia molekularna w medycynie' J.Bal PWN 2006

3. 'Biotechnologia molekularna' J.Buchowicz PWN 2009

4. 'Świat Nauki' - wydanie specjalne (Nadzieje Onkologii) 11/2009

Red. Anna Maciejewska