J. Bazan¹

¹Akademia Medyczna we Wrocławiu, Katedra  i Zakład Biochemii Lekarskiej,50-368 Wrocław, ul.Chałubińskiego 10

Teoretycznie każda struktura powierzchniowa bakterii może być użyta jako receptor. Bakteriofagi infekujące bakterie Gram-ujemne wykorzystują np. LPS (główne i boczne łańcuchy) i białka błony zewnętrznej. Natomiast fagi specyficzne w stosunku do bakterii Gram-dodatnich korzystają m.in. z kompleksów kwasów tejchojowych i C-węglowodanów. Także takie struktury jak rzęski i wici czy pilusy płciowe są rozpoznawane przez fagi [1].

Pierwsza barierą dla bakteriofagów infekujących bakterie Gram-dodatnie jest gruba ściana komórkowa, gęsto usieciowana przez kwasy tejchojowe, lipotejchojowe, polisacharydy, białka i glikoproteiny. Okazało się, że część z tych komponentów ściany komórkowej bierze udział w odwracalnej i nieodwracalnej adsorpcji faga.

Cukry związane z peptydoglikanem zawierające L-ramnozę pełnią funkcje receptorowe u Lactococcus lactis, Streptococcus thermophilus czy Lactobacillus casei. Glikozylowane kwasy tejchojowe mają kluczowe znaczenie w adsorpcji fagów do Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus i Lactobacillus plantarum. Najistotniejszym dla prawidłowego funkcjonowania receptorów kwasem tejchojowym wydaje się PGP (poli-[fosforan glicerolu]) i GTA (poli-[fosforan glukozo-N-acetylogalaktozaminy]). Białka receptorowe bakterii są słabiej poznane. Niektóre z nich należą do białek membranowych posiadających domenę przechodzącą przez peptydoglikan (rodzina białek YueB) inne, jak białko LPTXG z Bacillus anthracis, do białek GamR zakotwiczonych w peptydoglikanie [2]. Większość receptorów pełni określoną rolę w procesie koniugacji oraz w ochronie komórki, jednak są i takie, które biorą udział w transporcie komórkowym np. receptor dla bakteriofaga λ, biorący udział w pobieraniu maltozy [3].

Podczas plazmolizy komórek Escherichia coli zaobserwowano obecność od 200 do 400 miejsc, w których protoplast przylega do ściany komórkowej. Liczba ta jest równa liczbie miejsc receptorowych dla bakteriofagów w tych komórkach. Wykryto szereg bakteriofagów, które adsorbują dokładnie w tych rejonach. Pozwoliło to na określenie lokalizacji receptorów specyficznych dla bakteriofagów. Wiązanie się faga w tych charakterystycznych miejscach zapewnia mu najlepszy dostęp do cytoplazmy komórki i infekcji, nawet w niekorzystnych dla bakterii warunkach [4].

Tabela 1. Wybrane receptory bakteryjne dla fagów. Na podstawie źródła [2].

Bakteriofagi mogą wiązać się w różny sposób do tych samych receptorów, które mogą jednocześnie odpowiadać za adsorpcję odwracalną i nieodwracalną Dzieje się tak w przypadku bakteriofaga λ, który może tworzyć ze swoim receptorem dwa różne typy kompleksów. W typie pierwszym zachodzi wiązanie pomiędzy włóknami ogonka, a receptorem, tak, że ogonek znajduje się w odległości 17 nm od powierzchni komórki. W drugim typie kompleksów ogonek faga znajduje się w bezpośrednim kontakcie z komórką gospodarza. Oba typy wiązania są konieczne do prawidłowego przebiegu infekcji [5].

Badania nad strukturami odpowiedzialnymi za wiązanie bakteriofaga wykazały, że wirusy te mogą być inaktywowane przez związanie z sztucznymi receptorami, które zostały wbudowane np. w liposomy. Dodatkowo w wielu przypadkach genom bakteriofagowy zostaje wstrzyknięty do wnętrza pęcherzyka, sugerując brak dodatkowych struktur odpowiedzialnych za prawidłowy przebieg infekcji [6].

Oddziaływania z receptorami mogą być wzmacniane lub osłabiane przez wiele czynników tj. mutacje, temperatura, stężenia jonów.  Badania nad receptorem YueB pozwoliły na dokładne określenie kinetyki adsorpcji oraz czynników mających na nią wpływ. Dzięki dokładnemu poznaniu kinetyki wiązania odkryto strategię polegającą na nieustannym słabym i krótkotrwałym wiązaniu się faga SPP1 do powierzchni komórki i przeszukiwania jej pod kątem receptorów YueB. Strategię tą nazwano skanowaniem powierzchni [7].

Struktury posiadające aktywność receptorową są podobne u wielu bakterii, jednak wiązanie się bakteriofaga z tymi strukturami jest tak specyficzne, że nawet najmniejsza zmiana konformacji może spowodować całkowitą utratę zdolności do adsorpcji.

Rola LPS w adsorpcji bakteriofaga

Lipopolisacharyd (LPS, endotoksyna bakteryjna) to główny składnik błony zewnętrznej prawie wszystkich bakterii Gram−ujemnych. LPS jest czynnikiem odpowiedzialnym za patogenność bakterii, stanowi także ochronę przed elementami układu odpornościowego i utrudnia wnikanie związków hydrofobowych do komórki [8, 9]. LPS wpływa także niekorzystnie na rozwój bakterii, gdyż może być wykorzystywany przez bakteriofagi jako receptor ułatwiający adsorpcję wirusa. Z drugiej strony jednak niektóre jego elementy mogą hamować infekcję wywołaną fagami [10].

Lipopolisacharyd jest heteropolimerem.W jego budowie można wyróżnić trzy podstawowe elementy: lipid A, rdzeń (wewnętrzny i zewnętrzny) oraz O-antygen. Różne formy bakterii charakteryzują się inną długością łańcucha O-swoistego, najkrótszy łańcuch posiadają formy szorstkie, najdłuższy – gładkie, istnieją także formy głęboko szorstkie posiadające LPS o skróconym rdzeniu. Polisacharydowy łańcuch O-swoisty charakteryzuje duża zmienność budowy, w przeciwieństwie do hydrofobowego lipidu A oraz rejonu Kdo (kwas 2-keto-3-deoksyoktulozonowy) rdzenia, które są elementami o bardzo konserwatywnej strukturze [9, 11].

Duże zróżnicowanie łańcuchów O-swoistych (antygen powierzchniowy) jest przyczyną występowania wielu różnych serologicznie szczepów, nawet w obrębie tego samego gatunku. O−antygen jest homo− lub heteropolimerem składającym się z powtarzających się oligosacharydowych podjednostek, z których każda zawiera do ośmiu reszt monocukrowych. Podjednostki te wykazują zróżnicowanie pod względem składu chemicznego, kolejności ułożenia cukrów, typu wiązań, rodzaju odgałęzień bocznych oraz zawartości niecukrowych podstawników takich jak: aminokwasy, fosforany, rybitol, glicerol czy kwas sialowy. Cukry obecne w łańcuchu O−swoistym nadają mu charakter obojętny, kwaśny lub zasadowy [9].

Uwalnianie LPS ze ściany komórki bakteryjnej następuje na skutek namnażania bakterii lub lizy ich komórek np. w wyniku infekcji wirusem bakteryjnym. Cząsteczka lipopolisacharydu, gdy pozostaje związana ze ścianą komórki bakteryjnej, nie jest toksyczna, ale po odłączeniu, jej toksyczna część – lipid A przyczynia się do rozwoju odpowiedzi zapalnej. Niekontrolowane uwalnianie LPS do układu stanowi jedno z zagrożeń terapii fagowej [12, 13].

Podczas adsorpcji bakteriofag może rozpoznawać i wiązać się zarówno do białek jak i do węglowodanów znajdujących się na powierzchni bakterii. Wśród bakterii brodawkowych najczęściej spotykanym receptorem jest LPS i EPS. Zewnątrzkomórkowe polisacharydy (EPS) są receptorami naBradyrhizobium japonicum, natomiast bakteriofagi bakterii Rhizobium leguminosarum łączą się z LPS. Spotykane są także fagi, które wykorzystują jako receptor zarówno LPS jak i EPS, przy czym LPS jest receptorem głównym (odpowiada za nieodwracalne wiązanie faga). Badania wykazały, że częścią LPS odpowiedzialną za adsorpcje faga NM8 do bakterii Rhizobium jest rejon cukrowy, zawierający glukozę, glukozaminę, galaktozę, Kdo i kwas sjalowy, którego brak w komórce bakteryjnej wywołuje oporność na infekcje wirusową. Lipid A nie bierze udziału w procesie adsorpcji[14].  Receptorem dla bakteriofaga FC3-1 u Klebsiella pneumoniae C3 jest także LPS, a dokładniej jego polisacharydowa część (O-antygen i rdzeń). Tak jak w przypadku bakterii Rhizobiumlipid A, a także białka błony zewnętrznej nie biorą udziału w procesie adsorpcji. Ten szczep jest jak dotąd jedynym poznanym przedstawicielem Klebsiella, którego receptorem dla faga nie jest białko [15]. Także niektóre bakteriofagi infekujące Escherichia coli łączą się z receptorem jakim jest LPS tej bakterii [16].

Zintegrowanie genomu bakteriofagowego z genomem bakterii, a także wszelkie mutacje powstające w genomie, mogą prowadzić do zmian w strukturze LPS, osłabienia lub całkowitego zaniku jego syntezy. W przypadku, gdy LPS jest receptorem dla bakteriofaga skutkuje to nabyciem oporności na faga przez dany szczep bakteryjny [16, 17].

Badania nad rolą LPS w adsorpcji bakteriofaga wykazały, że w przypadku znacznej części poznanych wirusów bakteryjnych, w wiązaniu biorą udział specyficzne grupy znajdujące się w rdzeniu (w przypadku form szorstkich) oraz w rdzeniu i O-antygenie (w przypadku form gładkich). W wielu przypadkach, gdy głównym receptorem dla bakteriofagów jest LPS, za nieodwracalną adsorpcję odpowiadają całe kompleksy wchodzące w jego skład, a inne elementy warstw zewnętrznych bakterii tj. EPS czy białka pełnia rolę receptorów drugorzędnych.

Białka fagowe biorące udział w adsorpcji

Dla wielu bakteriofagów białka odpowiedzialne za adsorpcję zostały dobrze poznane i scharakteryzowane. W wielu przypadkach także z powodzeniem ekspresjonowano te białka i określano ich strukturę oraz izolowano i badano ich kompleksy z receptorami bakteryjnymi. Białka fagowe odpowiedzialne za adsorpcję określane są jako Rbp (receptor-binding proteins) i są zlokalizowane w rejonach Rbp znajdujących się w najbardziej peryferyjnych częściach wirusa.

Bakteriofag λ posiada białko gpJ, które oddziałuje z bakteryjnym białkiem LamB tworząc kanał niezbędny do prawidłowego przebiegu infekcji. Bakteriofag filamentowy Ff na jednym ze swoich końców posiada białko g3p, które jest częścią kompleksu adsorpcyjnego.

Fag T5 posiada wyjątkową strukturę biorącą udział w adsorpcji, gdyż białko za nią odpowiedzialne nie znajduje się w peryferycznej części cząstki wirusowej. T5 posiada dwa typy włókien ogonka. Trzy z nich są L-kształtne (LTF), a jeden, centralnie ułożony, jest prosty (STF). LTF wiąże się za pomocą końcówek włókien z antygenem O polimannozy w E. coli. Wtedy to STF formuje około 6 kopii białka ogonka pb2, które nie jest odpowiedzialne za adsorpcję, ale za penetrację. Nieodwracalne wiązanie faga T5 do komórki gospodarza zachodzi z udziałem białka pb5_T5, które dzięki zmianom w STF zostaje przetransportowane na koniec ogonka [18].

Bakteriofagi infekujące Lactococcus lactis zostały sklasyfikowane w 3 grupy 936, P335 i c2. Bakteriofagi c2 po związaniu się odwracalnie z węglowodanami na powierzchni komórki, wiążą się nieodwracalnie z drugim receptorem (PIP), natomiast fagi z pozostałych grup nie wymagają wiązania się z PIP. Przedstawicielem grupy 936 jest fag p2, dla którego poznano strukturę białka ORF18 należącego do Rbp [19]. Homologiczne białka oraz geny je kodujące odnaleziono w CHL92 (ORF2), bIL67 (ORF35).ORF18 odnaleziono także w fagu skl, a białko ORF20 odkryto w fagu  bIL170. Badania nad tymi białkami Rbp doprowadziły do podziału bakteriofagów typu 936 na dwie grupy Skl-podobne fagi  (p2, fd13, jj50 i Φ7) oraz bIL170- podobne fagi  (P008, P113G, P272 i bIL66) bazując na homologii ich Rbp [20].

Badania nad białkami fagowymi oraz dostępność narzędzi bioinformatycznych pozwoliły na określanie podobieństw w sekwencji i strukturze różnych białek fagowych odpowiedzialnych za adsorpcję. Odkryto, że w wielu przypadkach C-koniec białka nie bierze udziału w tym procesie, a zmiany w sekwencji na N-końcu mogą prowadzić do zaniku oddziaływań z receptorem bakteryjnym.

literatura:

[1] Lindberg, A.A., Bacteriophage Receptors, Annual Review of Microbiology, 1973, 27, 205-241

 [2] Vinga, I., Sao-Jones, C., Tavares, P.,Santos, M.A., Bacterophage entry in the host cell, w G. Węgrzyn (red.), Modern bacteriophage biology and biotechnology. Research Signpost, Trivandrum, India, 2006

[3] Randall-Hazelbauer, L., Schwartz, M., Isolation of the Bacteriophage Lambda Receptor from Escherichia coli, Journal Of Bacteriology,  1973, 116(3), 1436-1446

[4] Bayer, M. E., Adsorption of Bacteriophages to Adhesions Between Wall and Membrane of Escherichia coli, Journal Of Virology, 1968, 2(4), 346-356

[5] Roessner, C.A., Struck, D.K., Ihler, G.M., Morphology of Complexes Formed Between Bacteriophage Lambda and Structures Containing the Lambda Receptor, Journal Of Bacteriology, 1983, 153(3), 1528-1534

[6] Roessner, C.A., Struck, D.K., Ihler, G.M., Injection of DNA into Liposomes by   Bacteriophage λ, The Journal Of Biological Chemistry, 1983, 258 (1),  643-648

[7] Baptista, C., Santos, M.A., Sa˜o-Jose’, C., Phage SPP1 Reversible Adsorption to Bacillus subtilis Cell Wall Teichoic Acids Accelerates Virus Recognition of Membrane Receptor YueB, Journal Of Bacteriology,  2008, 190(14), 4989-4996

[8] Saluk-Juszczak, J., Znaczenie lipopolisacharydu bakteryjnego w procesie aktywacji płytek krwi, Postępy biologii komórki, 2007, 34 (1), 159-172

[9] Tichaczek−Goska,D., Cisowska, A., Wybrane właściwości lipopolisacharydów bakterii Gram−ujemnych zawierających mannan w łańcuchu O−swoistym, Adv Clin Exp Med, 2007, 16(1), 105-112

[10] Jarrell, K.F., Kropinski, A.M., Pseudomonas aeruginosa Bacteriophage 4PLS27- Lipopolysaccharide Interactions, Journal Of Virology, 1981, 40(2), 411-420

[11] Lodowska, J., Zięba, A., Wolny, D., Węglarz, L., Dzierżewicz, Z., Metody derywatyzacji komponentów liposacharydów w ocenie ich struktury chemicznej technikami chromatograficznymi, Postępy Hig Med Dośw., 2006, 60, 113-128

[12] Mierzchała, M., Lipińska−Gediga, M., Durek, G., The Role of LBP in Transduction of Signal Induced by LPS and in Modulation of Immune System Response, Adv Clin Exp Med, 2006, 15(1), 127-134

[13] Van Amersfoort E.S., Van Berkel T.J., Kuiper J., Receptors, mediators, and mechanisms involved in bacterial sepsis and septic shock. Clin Microbiol Rev, 2003, 16, 379-414

[14] Defives, C., Werquin, M., Mary, P., Hornez, J.P., Roles of Exopolysaccharides and Lipopolysaccharides in the Adsorption of the Siphovirus Phage NM8 to Rhizobium meliloti M11S Cells, Current Microbiology, 1996, 33, 371-376

[15] Tomas, J.M.,Jofre, J.T., Lipopolysaccharide-Specific Bacteriophage for Klebsiella pneumoniae C3, Journal Of Bacteriology, 1985, 162(3), 1276-1279

[16] Hancock, R.E.W., Reeves, P., Lipopolysaccharide-Deficient, Bacteriophage-Resistant Mutants of Escherichia coli K-12, Journal Of Bacteriology, 1976, 127(1), 98-108

[17] Chart, H., Threlfall, E.J.,  Ward, L.R., Rowe, B., Unusual expression of lipopolysaccharide by strains of Salmonella enteritidis phage type 30, Letters in Applied Microbiology, 1993, 16, 87-90

[18] Mondigler, M., Holz, T., Heller, K. J., Identification of the Receptor-Binding Regions of pb5 Proteins of Bacteriophages T5 and BF23, Virology, 1996, 219, 19-28

[19] Tremblay, D.M., et al, Receptor-Binding Protein of Lactococcus lactis Phages: Identification and Characterization of the Saccharide Receptor-Binding Site, Journal Of Bacteriology, 2006, 188(7), 2400-2410

[20] Dupont, K., Vogensen, F.K., Neve, H., Bresciani, J., Josephsen, J., Identification of the Receptor-Binding Protein in 936-Species Lactococcal Bacteriophages, Applied And Environmental Microbiology, 2004, 70 (10), 5818-5824