J. Bazan¹

¹Akademia Medyczna we Wrocławiu, Katedra  i Zakład Biochemii Lekarskiej, 50-368 Wrocław, ul.Chałubińskiego 10

Bakteriofagi występują we wszystkich środowiskach, atakując ponad 140 rodzajów bakterii [1]. Wirusy te przystosowały się do istnienia nawet w najbardziej ekstremalnych warunkach atakując takie grupy ekstremofili jak barofile, halofile [2], acydo- i alkalifile, a także wszelkiego rodzaju termo- i psychrofile [3]. Gospodarzami dla opisywanych tu wirusów są mikroorganizmy z wszystkich grup systematycznych np. Archaea, Eubacteria, Cyanobacteria. Gospodarzami bakteriofagów są nie tylko mikroorganizmy w formie wegetatywnej,  ale również egzo- i endospory, pączki, aeroby i anaeroby, a także wszystkie możliwe formy morfologiczne (np. krętki, bakterie otoczkowe, rozgałęzione, chlamydie). Cząstki Podowirusów zostały znalezione nawet wewnątrz endosymbiontów bakteryjnych [1]. Zakres gospodarzy dla głównych grup bakteriofagów przedstawia Tabela 1.

Tabela 1. Zakres gospodarzy dla głównych grup bakteriofagów. Na podstawie źródła [1].

Już F.H. d’Hérelle zauważył, że niektóre fagi atakują tylko ściśle określony szczep bakterii, natomiast inne posiadają szeroki zakres wirulencji, atakując mikroorganizmy różnych rodzajów. Bakteriofagi mogące atakować tylko jeden gatunek bakterii nazywa się monowalentnymi, natomiast te o szerszym zakresie gospodarzy poliwalentnymi.

Fagi poliwalentne atakują różne szczepy bakterii i mogą w każdym z nich przechodzić inny cykl rozwojowy, który może także być uzależniony od kondycji bakterii (fazy rozwoju w jakiej się znajduje). Dzięki mutagenezie i relatywnie krótkim cyklom rozwojowym gospodarza, może okazać się, że dany fag utracił lub zmodyfikował możliwość adsorpcji i rozwoju w dotychczasowym gospodarzu. Dzieje się tak głównie za sprawą zmian w genomie gospodarza prowadzących do zmian w powierzchni bakterii, które albo całkowicie modyfikują receptor uniemożliwiając adsorpcję, albo wprowadzają różne modyfikacje powierzchni np. zmiany ładunku czy konformacji [4].

Odkryto także wiele zależności między różnymi bakteriofagami, które mają znaczący wpływ na wybór i możliwość adsorpcji do gospodarza, a także na rodzaj infekcji. Bakteriofagi po wniknięciu do gospodarza mogą zmieniać jego fenotyp. Wiele z nich jest nośnikiem genów kodujących toksyny, białka pozwalające bakterii na skolonizowanie nowego gospodarza (zmiany w LPS i antygenach), czy zmianę jego systemu obrony (kodowanie nowych enzymów). Bardzo często jeden rodzaj bakteriofaga nie jest w stanie wprowadzić tak znaczących zmian w bakterii, a do pełnej aktywacji tych genów potrzebne są tzw. bakteriofagi pomocnicze. Bakteriofagi pomocnicze mogą działać na 3 różne sposoby. Po pierwsze, dzięki ich obecności w komórce bakteryjnej inny, mniejszy bakteriofag może przechodzić kompletny cykl rozwojowy, wykorzystując enzymy bakteriofaga pomocniczego. Taki proces nazywa się mobilizacją bakteriofaga. Innym typem zależności między fagami jest ich wspólne uczestnictwo w kodowaniu toksyn bakteryjnych. Współudział ten może przebiegać na wiele różnych sposobów. Każdy bakteriofag może posiadać fragment genu kodującego toksynę lub kodować białka aktywujące. Jedyną wspólną cechą dla tej zależności jest fakt, iż tylko dane wirusy występujące wspólnie w ściśle określonym gospodarzu powodują wytwarzanie toksyn lub innych szkodliwych dla gospodarza bakteryjnego substancji. Trzecim i ostatnim poznanym rodzajem zależności typu bakteriofag-bakteriofag jest zmiana fenotypu gospodarza zainfekowanego jednym fagiem, tak, by wytworzył na swojej powierzchni receptory potrzebne do adsorpcji i wniknięcia innego faga. Jak dotychczas znany jest tylko jeden taki przypadek. Częściej jednak opisywano przeciwne interakcje np. utrata zdolności innych wirusów do infekcji komórki gospodarza, w którym istniał już inny bakteriofag (najczęściej w formie profaga), nawet jeśli nie obserwowano zmian w obrębie ligandów dla tych wirusów [5, 6].

Tabela 3. Przykłady interakcji bakteriofag-bakteriofag [5].

Pomimo iż znane są liczne zależności fag – gospodarz, to dla większości znanych wirusów gospodarzami są łatwe w hodowli mikroorganizmy istotne z punktu widzenia przemysłu i medycyny. Fakt ten oraz duża zmienność genotypowa i fenotypowa zarówno wśród gospodarzy jak i wirusów stwarza nadzieje na kolejne liczne odkrycia w tej dziedzinie.

Strategie przetrwania fagów na przykładzie fagów E.coli

W naturalnym środowisku bakterie rosną wolno. Escherichia coli, bakteria bytująca w jelitach, w warunkach laboratoryjnych przechodzi podziały co 20-30 min. Jednak badania wykazały, że w swoim naturalnym środowisku  powstawanie kolejnych pokoleń może zachodzić co 40-80 min, 4 godziny, a nawet 140 godziny. Jelita nie są tylko miejscem bytowania kilkuset gatunków bakterii, ale również bakteriofagów. Wypracowały one systemy pozwalające im na zasiedlenie i przetrwanie w tym środowisku [7].

Lizogenia jest najpopularniejszą metodą wykorzystywaną przez colifagi. W ten sposób bakteriofag zapewnia sobie „wygodne życie” wewnątrz bakterii, a dodatkowo nie jest silnym czynnikiem niszczącym bakterie, więc E. coli nie wypracowuje systemów obronnych skierowanych na colifaga. Bakteriofag λ jest znakomitym przykładem dostosowania się do bytowania w jelitach. Potwierdza to zdolność do przeprowadzenia przez tego faga lizy w temperaturze pokojowej, jedynie po uszkodzeniu DNA bakterii. Bakteriofag λ nie jest zdolny do wprowadzenia swojego DNA do bakterii w niskich temperaturach, oraz nie przechodzi w tych warunkach do cyklu litycznego (nawet po indukcji). Dzięki aktywnym genom operonowym rexA i rexB [8] dostarczanym wraz z genomem fagowym, następuje  zahamowanie programowanej śmierci komórki [7].

Także wywoływanie chronicznej infekcji przez takie filamentowe fagi jak M13, fd, fl i AE2 wydaje się być dobrą strategią przetrwania. Tak jak w przypadku lizogenii i tu zdolność do infekcji jest zależna od temperatury, gdyż tylko w temp. zbliżonej do temp. ciała wytwarzane są pilusy płciowe, do których przyłączają się te fagi [9].

Wirulencja, a w szczególności totalna wirulencja nie są dobrymi strategiami przetrwania. Oczywiście pozwalają na szybką ekspansję faga, jednak w konsekwencji powodują utratę gospodarza (przez lizę całej populacji lub przez uodpornienie się gospodarza na infekcję) [7].

Poza jelitem colifagi a także inne grupy bakteriofagów wykorzystują te same strategie przetrwania.

Strategie pozwalające bakteriom przetrwać infekcję

Bakterie posiadają kilka możliwości obrony przed atakiem ze strony bakteriofaga. Główną metodą obrony przed infekcją jest zdolność do degradacji i neutralizacji genomu bakteriofagowego. Jeśli to się nie uda, komórka ulega samozniszczeniu, by chronić inne bakterie przed infekcją. Dość często występują różne mutacje antygenów powierzchniowych, które mogą prowadzić do uodpornienia się na infekcję.

Rozwój bakteriofaga może być hamowany przez egzo- i endonukleazy. Wiele bakterii wypracowało systemy enzymatyczne, które w pierwszej kolejności usuwają modyfikacje nukleotydów (np. metylacje), by nukleazy mogły działać. Jednak ten system zawodzi w przypadku silnych modyfikacji genomu. Popularne enzymy restrykcyjne nie potrafią strawić T4 DNA.

Bakterie E. coli posiadają enzymy trawiące DNA tego faga na różnych etapach jego rozwoju. Do takich enzymów restrykcyjnych należy EcoV (RecBCD egzonukleaza), a hydroksymetylacja cytozyny w DNA fagowym sprawia, że jest ono podatne na działanie enzymów restrykcyjnych tj. Rgl czy mcr [10]. Bakteriofagi wypracowały jednak systemy pozwalające na ochronę ich genomu przed działaniem tych enzymów. W tym celu pierwsze etapy syntezy DNA i hydroksymetylacja zachodzą w kompleksach replikacyjnych DSC, służących przede wszystkim do pozyskiwania nukleotydów. Jest to najbardziej rozwinięta strategia ochrony genomu wirusowego przed endonukleazami występująca jedynie dla fagów T4. Bakterie kodują także RNazy, np. RNazę E będącą częścią degradosomu RNA. Obroną przed nimi jest wytwarzanie nieaktywnych cząsteczek RNA (zmodyfikowanych), które zostają uaktywniane dzięki działaniu bakteryjnych RNaz [11].

Samodestrukcja jest metodą ochrony populacji. Najlepiej poznano ten proces w mutantach rII faga T4, gdzie w procesie tym biorą udział produkty genu rex, [12] oraz w fagu T7, gdzie proces ten zachodzi jedynie w męskiej części populacji (zawierającej plazmid F). W obu przypadkach infekcja prowadzi do uszkodzenia błony i destrukcji komórki, chociaż mechanizm procesów jest inny. Inne mechanizmy samodestrukcji takie jak prr i lit opierają się na zmianach w procesie translacji. Trzecia metoda samodestrukcji opiera się na niepoprawnej syntezie białek kapsydu. U E. coli system ten wykorzystuje zmiany w funkcjonowaniu chaperonów typu GroE (GroEL i GroES), co prowadzi do złej formacji białka kapsydowego gp23, osadzania się jego nierozpuszczalnej formy na błonie komórkowej i śmierci komórki [11].

Kolejnymi wspominanymi już w tej pracy metodami pozwalającymi bakterii przetrwać infekcję są lizogenizacja i modyfikacja powierzchni komórki.

Dokładne poznanie strategii pozwalających bakterii przetrwać infekcję oraz systemów bakteriofagowych pozwalających na pokonanie tych barier ma ogromne znaczenie dla ograniczenia problemów w terapii fagowej i poprawienia jej skuteczności.

literatura:

[1] Ackermann, H. W., Bacteriophage observations and evolution, Research in Microbiology 2003, 154, 245-251

[2] Porter, K., Russ, B.E., Dyall-Smith, M.L.,Virus – host interactions in salt lakes, Current Opinion in Microbiology 2007, 10, 418-424

[3] Breitbart, M., Rohwer, F., Here a virus, there a virus, everywhere the same virus?, Trends in Microbiology, 2005, 13(6), 278-284

[4] Adams, M.H., Bacteriophages, Interscience publishers INC., New York, 1959

[5] Boyd, E.F., Davis, B.M., Hochhut, B., Bacteriophage – bacteriophage interactions in the evolution of pathogenic bacteria, Trends in Microbiology, 2001, 9(3), 137-144

[6] Chibani-Chennoufi,S., Bruttin,A., Dillmann, M.L., Brüssow, H., Phage-Host Interaction: an Ecological Perspective, Journal of bacteriology, 2004, 186(12), 3677-3686

[7] Łoś, M., Coliphages in their natural enviroment: Strategies of survival, w G. Węgrzyn (red.), Modern bacteriophage biology and biotechnology. Research Signpost, Trivandrum, India, 2006

[8] Hayes, S., Salvacev, R.A., The Rex phenotype: Pursuing a legendary genetic mystery, w G. Węgrzyn (red.), Modern bacteriophage biology and biotechnology. Research Signpost, Trivandrum, India, 2006

[9] Woody, M.A., Cliver, D.O., Effects of Temperature and Host Cell Growth Phase on Replication of F-Specific RNA Coliphage Qb, Applied and Enviromental Microbiology, 1995, 61, 1520-1526

[10] Piekarowicz, A., Yuan, R.Y., Steind, D.C., Isolation of temperature-sensitive McrA and McrB mutations and complementation analysis of the McrBC region of Escherichia coli K-12, Journal of Bacteriology, 1991, 173, 150-155

[11] Nieradko, J., Łoś, M., Strategies by which a bacterial population can survive phage infections, w G. Węgrzyn (ed.), Modern bacteriophage biology and biotechnology. Research Signpost, Trivandrum, India., 2006

[12] Mondigler, M., Holz, T., Heller, K. J., Identification of the Receptor-Binding Regions of pb5 Proteins of Bacteriophages T5 and BF23, Virology, 1996, 219, 19-28