Odkrycie w ostatnich latach rodziny jedenastu receptorów Toll-podobnych, tzw. TLR (ang. toll-like receptors), kodowanych przez DNA linii zarodkowej, pokazało, że w obrębie odporności wrodzonej funkcjonuje złożony system rozpoznawania struktur powierzchniowych i wewnętrznych drobnoustrojów, którego aktywacja prowadzi do uruchomienia ważnych mechanizmów efektorowych odporności wrodzonej i uczestniczy w kształtowaniu odporności nabytej.

Ogólna charakterystyka

Odkrycie w ostatnich latach rodziny jedenastu receptorów Toll-podobnych, tzw. TLR (ang. toll-like receptors), kodowanych przez DNA linii zarodkowej, pokazało, że w obrębie odporności wrodzonej funkcjonuje złożony system rozpoznawania struktur powierzchniowych i wewnętrznych drobnoustrojów, którego aktywacja prowadzi do uruchomienia ważnych mechanizmów efektorowych odporności wrodzonej i uczestniczy w kształtowaniu odporności nabytej. Cząsteczki TLR ulegają ekspresji na komórkach kontaktującymi się bezpośrednio lub pośrednio z drobnoustrojami i substancjami pochodzenia zewnętrznego obecnymi w świetle przewodu pokarmowego, dróg oddechowych, układu wydalniczego i dróg płciowych. Cząsteczki te biorą udział w obronie organizmu gospodarza przeciw patogenom poprzez: (1) rozpoznawanie molekularnych wzorów obecnych na powierzchni drobnoustrojów, (2) indukcję efektorowych procesów przeciwdrobnoustrojowych, (3) pobudzenie wydzielania cytokin prozapalnych i przeciwzapalnych, co stanowi proces łączący odporność wrodzoną z odpornością nabytą.

Pierwsze doniesienia dotyczące receptorów Toll-podobnych pochodzą z początku lat 90 ubiegłego wieku, kiedy zidentyfikowano cząsteczkę TLR1, później potwierdzono obecność kolejnego receptora z tej rodziny – TLR4 . W kolejnych latach odkrywano cząsteczki TLR2, 3 oraz TLR6. Obecnie znanych jest kilkanaście cząsteczek z tej rodziny, choć funkcja niektórych z nich do dziś nie została poznana. Większość cząsteczek TLR posiada przynajmniej jednego agonistę, a wyjątkiem jest w tym przypadku ludzki receptor TLR10 oraz mysie cząsteczki TLR12 oraz TLR13. Ligandy cząsteczek TLR są w przeważającej liczbie przypadków dobrze poznanymi wzorcami molekularnymi związanymi z patogenami (PAMP) . Cząsteczki PAMP pochodzą od większości grup organizmów patogennych – posiadają je wirusy, bakterie, grzyby i pierwotniaki. . Zidentyfikowane cząsteczki PAMP przedstawiono w tabeli 1.

Budowa cząsteczek TLR

Receptory Toll-podobne różnią się od siebie pod względem komórek na których ulegają ekspresji, szlaków wewnątrzkomórkowego przekazywania sygnałów, specyficzności ligandów które rozpoznają i typu odpowiedzi immunologicznej, którą wzbudzają. Cząsteczki TLR są rodziną przezbłonowych (przechodzących przez błonę komórkową lub endosomu) receptorów, które wykazują trzy wspólne cechy strukturalne: (1) obecność w części zewnątrzkomórkowej domen bogatych w leucynę (LRRs – ang. leucine rich repeats), które wiążą różne ligandy, (2) krótki region przezbłonowy, (3) występowanie cytoplazmatycznej domeny TIR (ang. toll/interleukin 1 receptor) homologicznej do wewnątrzkomórkowej domeny receptora dla IL-1niezbędnej i niezbędnej do zapoczątkowania kaskady sygnałowej . Wewnątrzkomórkowa domena TIR cząsteczek TLR jest konserwatywną sekwencją składającą się z około 200 aminokwasów. W obrębie tej struktury, regiony homologii układają się w trzy segmenty zasadnicze dla procesów przekazywania sygnału wewnątrzkomórkowego, a powtarzalna sekwencja aminokwasów w tym regionie obejmuje 20-30% całej sekwencji. Środkowa część tej domeny składa się z białka o drugorzędowej strukturze typu β- otoczonej przez struktury o budowie α-helikalnej. Poszczególne białka połączone są za pomocą pętli i odpowiadają za interakcje z białkami adaptorowymi w procesie wewnątrzkomórkowego przekazywania sygnału .

Zewnątrzkomórkowy fragment cząsteczek TLR zawiera 19-25 tandemowych kopii motywu LRR zawierających: 24-29 aminokwasów, bogatą w leucynę sekwencję XLXXLXLXX oraz dodatkową, również konserwatywną, sekwencję XØXXØX4FXXLX, (gdzie X to dowolny aminokwas, a Ø to aminokwas hydrofobowy). Powtórzenia te składają się z odcinków o drugorzędowej strukturze α lub β połączonych przez pętle. Domena LRR cząsteczek TLR tworzy strukturę przypominającą podkowę (ang. horsehoe-like structure), która zaangażowana jest bezpośrednio w rozpoznawanie ligandów .

Charakterystyka poszczególnych cząsteczek TLR

Cząsteczki TLR2

Cząsteczki TLR2 ulegają konstytutywnej ekspresji na wielu populacjach komórek, a na niektórych ich ekspresja jest indukowana . Wśród ligandów tego receptora wymienia się kwasy lipotejchojowe (LTA) i peptydoglikan stanowiące składnik ściany komórkowej bakterii Gram-dodatnich , lipoproteiny bakteryjne , lipoproteiny mykoplazm , lipoarabinomannan prątków kwasoodpornych , rozpuszczalną modulinę Staphylococcus epidermidis , zymosan drożdzy, glikofosfatydyloinozytol świdrowca Trypanosoma cruzi i inne (tabela 1). Ciekawy jest fakt, że TLR2 mediuje rozpoznawanie także atypowego LPS bakterii Porphyromonas gingivalis . TLR2 wymaga do swojego funkcjonowania cząsteczek kooperujacyh. Rozpoznawanie PGN wymaga obecności CD-14, natomiast do wiązania lipoprotein wymagana jest cząsteczka CD36.

Cząsteczka TLR2 współpracuje z dwoma innymi receptorami z tej rodziny – TLR1 i TLR6. Heterodimer tworzony przez cząsteczki TLR1/TLR2 różni się repertuarem rozpoznawanych PAMP w stosunku do heterodimeru utworzonego przez cząsteczki TLR2/TLR6. Triacylowane lipopeptydy i MALP-2 (mycoplasmal macrophage-activating lipopeptide 2kD) nie indukują wewnątrzkomórkowego przekazywania sygnału u myszy z nokautem genu dla TLR2, a w przypadku nokautu genu dla TLR6 bark jest odpowiedzi komórkowej jedynie na MAPL-2. Rozpoznawanie tripalmitynowanych lipopeptydów wymaga heterodimeryzacji receptora TLR1 i TLR2. Obecnie bark jest danych na temat heterodimeryzacji wszystkich receptorów Toll-podobnych, ale niektóre badania wskazują na możliwość tworzenia hetero dimerów przez cząsteczki TLR4 i TLR5.

Cząsteczka TLR4

TLR4 jest receptorem dla LPS. Cząsteczka ta jest kluczowa w rozpoznawaniu i odpowiedzi szeregu różnych populacji komórek na najważniejszy składnik osłon komórkowych bakterii Gram-ujemnych. Swoistość tę odkryto dzięki analizie reaktywności względem LPS szczepu myszy wsobnych C3H/HeJ (szczep posiadający punktową mutację w genie kodującym domenę TIR) oraz myszy z nokautem genu kodującego TLR4. Niedawno odkryto, że cząsteczka TLR4 odpowiada także za rozpoznawanie ligandów innych niż LPS. TLR4 może rozpoznawać min. wrażliwy na ciepło czynnik związany z Mycobaterium tuberculosis, wraz z CD-14 wiąże białko fuzyjne wirusa RSV oraz wiele innych (tabela 1). Rozpoznanie LPS przez cząsteczkę TLR4 jest procesem złożonym i wymaga obecności szeregu dodatkowych białek. W pierwszej fazie LPS wiąże się z LBP (ang. LPS-binding protein). LBP jest białkiem surowiczym wiążącym LPS i przekazującym endotoksynę na cząsteczkę CD14. Cząsteczka CD14 jest związana z glikozylofosfatydyloinozytolem (GPI) błony komórkowej, a jej rozpuszczalna forma (sCD14) występuje także w surowicy. Obydwie formy, zarówno błonowa jak i rozpuszczalna, wiążą LPS z silnym powinowactwem. W przypadku CD14 dokładny mechanizm łączenia się z LPS nie został wyjaśniony, ale rola tej cząsteczki jest niezaprzeczalna – myszy z defektem CD14 mają zaburzoną odpowiedź na podanie LPS. Zewnątrzkomórkowa domena TLR4 jest powiązana z kolejną cząsteczką towarzyszącą receptorowi – MD2. MD2 jest małym białkiem, które nie posiada części przezbłonowej, a ulega ekspresji na powierzchni komórki wraz z cząsteczką TLR4 i jest niezbędna do rozpoznawania LPS. CD14 oraz MD2 nie wyczerpują listy cząsteczek kooperujących z cząsteczką TLR4. Do kompleksu dołącza się także RP105, która posiada swój własny koreceptor MD-1, będący homologiem MD-2. Białko RP105 jest związane także z odpowiedzią komórek na niektóre lipoproteiny bakteryjne - ligandy TLR2.

Cząsteczka TLR3

Receptor ten może warunkować odpowiedź na motywy wirusowe w wielu populacjach komórek w organizmie. Ligandem cząsteczki TLR3 jest dwuniciowe (ds) RNA. dsRNA jest wzorcem molekularnym związanym z wirusami produkowanym w ściśle określonym momencie cyklu replikacyjnego. dsRNA wraz ze swoim syntetycznym analogiem - poly(I:C) są silnymi czynnikami prozapalnymi łaczącymi się z czasteczkami TLR3 obecnymi w przedziałach wewnątrzkomórkowych.

Cząsteczka TLR5

Cząsteczka TLR5 jest receptorem dla flageliny – konserwatywnego białka, które w wyniku procesu polimeryzacji tworzy wici bakteryjne [38]. TLR5 ulega ekspresji na wielu komórkach, zwłaszcza tych, które obecne są w warstwie lamina propria. Na uwagę zasługuje fakt, że na komórkach nabłonka jelitowego, ekspresja cząsteczki TLR5 jest spolaryzowana i ograniczona jedynie do podstawno-bocznej powierzchni komórki.

Cząsteczki TLR7 i TLR8

TLR7 i TLR8 posiadają wiele wspólnych funkcji. Obydwa receptory są związane z rozpoznawaniem wirusów i obydwa łączą się z kwasami nukleinowymi tych patogenów. Ligandem dla cząsteczek TLR7 i TLR8 jest jednoniciowe (ss)RNA. Endocytoza wirusów przez komórki powoduje odsłonięcie genomu wirusowego, a kwasy nukleinowe z którego się składa są rozpoznawane przez TLR7 oraz TLR8 w zasadowym środowisku późnego endosomu i lizosomu. Dowiedziono, że cząsteczka TLR7 jest zdolna rozpoznawać różnorodne ssRNA pochodzące od wirusów Sendai, VSV czy grypy.

Cząsteczka TLR9

DNA zawiera niemetylowane dinukleotydy CpG, które znane są ze swoich właściwości immunostymulacyjnych. CpG DNA są ligandem cząsteczki TLR9, która ulega ekspresji na limfocytach B oraz makrofagach. Po związaniu ligandu, TLR9 ulega internalizacji do endosomów lub lizosomów i zapoczątkowuje reakcję komórki na pojawienie się ligandów wirusowych.

Cząsteczki TLR11, TLR12, TLR14

Cząsteczki TLR11, TLR12 oraz TLR13 odnajdowane są w komórkach myszy, ale nie komórkach człowieka. Mysi receptor TLR11 odgrywa rolę w obronie przeciwko bakteriom uropatogennym. Co więcej, TLR11 odgrywa kluczową rolę w procesach odpornościowych skierowanych przeciwko pierwotniakowi Toxoplasma gonidii, wiążąc jedno z głównych białek o właściwościach antygenowych tego pasożyta – profilinę.

Drogi przekazywania sygnału przez cząsteczki TLR

Poszczególne cząsteczki różnią się między sobą pod względem sposobu w jaki sygnał wewnątrzkomórkowy przekazywany jest po ich aktywacji. W pierwszym etapie ligandy łączą się z cząsteczkami TLR. Następnie sygnał jest przekazywany dzięki kolejnym cząsteczkom biorącym udział w wewnątrzkomórkowej transdukcji sygnału. Ta sekwencja zdarzeń doprowadza do aktywacji NF-κB i transkrypcji genów ważnych w procesach odpornościowych. Ze względu na udział najważniejszej cząsteczki adaptorowej MyD88 szlaki przekazywania sygnału wskutek aktywacji TLR podzielona na dwa rodzaje.

Zależna od MyD88 droga przekazywania sygnału przez cząsteczki TLR jest analogiczna do tej, która zachodzi w przypadku IL-1R. Rekrutacja cząsteczki MyD88 do cząsteczki TLR doprowadza do związania się domeny śmierci cząsteczki MyD88 z domeną śmierci w kinazie serynowo-treoninowej, zazwyczaj jest to kinaza związana z receptorem dla IL-1 (IRAK – ang. interleukon 1 receptor associated kinase). Kinaza IRAK łączy się z TRAF6, czynnikiem 6 związany z receptorem TNF (ang. tumour necrosis factor receptor-associated factor). Połączenie IRAK z TRAF6 prowadzi do uruchomienia dwóch niezależnych dróg przekazywania sygnału. Pierwsza z nich prowadzi do aktywacji czynnika transkrypcyjnego AP-1 poprzez aktywację kinaz MAP (ang. mitogen-activated protein kinase). Druga droga doprowadza do aktywacji kompleksu TAK1/TAB składającego się z kinaz związanych z transformującym czynnikiem wzrostu beta TAK1 (ang. TGFβ-activated kinases) oraz TAB - białka wiążącego TAK-1 (ang. TAK-1-binding protein 1), który wzmaga działanie kompleksów kinazy IκB - IKK (ang. inhibitory protein of kappa B kinase). Raz aktywowany kompleks IKK indukuje fosforylację i następnie degradację IκB, która prowadzi do aktywacji NF-κB. Aktywacja NF-κB prowadzi do zmiany ekspresji wielu genów odpowiedzialnych za wydzielanie szeregu cytokin, m.in. IL-1, IL-6, TNF, IL-8, a wśród nich chemokin RANTES (ang. regulated on activation, normal T expressed and secreted ), IP-10 (ang. interferon inducible protein-10) oraz CCL20. Aktywacja NF-κB stymuluje też ekspresję cząsteczek MHC oraz cząsteczek kostymulujących, co sprzyja procesowi prezentacji antygenu. W procesie przekazywania sygnału może brać udział także inne białko zawierające domenę TIR – TIRAP (ang. TIR-domain-containing adaptor protein zwaną także MAL, MyD88 adaptor-like protein).

Wykazano także, że stymulacja komórek przez TLR4 prowadzi do aktywacji czynnika transkrypcyjnego IRF-3 oraz do aktywacji czynnika NF-κB na drodze niezależnej od MyD88. Drogę przekazywania sygnału niezależną od MyD88 można przedstawić w skrócie: kompleks TLR-ligand przyłącza białko adaptorowe TRAM (ang. TRIF-related adaptor molecule), następnie dołącza się białko TRIF (ang. TIR-domain adapter inducing IFN-β). Powstały kompleks łączy się z czynnikiem TRAF6, a dalej aktywowany jest jądrowy czynnik transkrypcyjny NF-κB.