Badanie funkcji genów stanowi istotę genetyki molekularnej od początku jej istnienia. Znaną i powszechnie stosowana metodą poznawania funkcji genów jest metoda zaburzająca ich prawidłowe działanie. Do tego celu wykorzystuje się epigenetyczne mechanizmy wyciszania ekspresji genów przez krótkie fragmenty RNA. Proces nosi nazwę interferencji RNA. Początkowo do wyciszania ekspresji genów stosowano krótkie oligonukleotydy o sekwencji komplementarnej do sekwencji mRNA docelowego genu, tzw. antysensowne RNA. Właściwym czynnikiem odpowiadającym za potranskrypcyjne wyciszanie genów są jednak krótkie fragmenty dwuniciowego RNA (ds.RNA). Takie fragmenty powstają poprzez działalnie w komórkach enzymu Dicer. Wprowadzenie dsRNA o sekwencji odpowiadającej sekwencji docelowego genu jest skuteczną metodą wyciszenia jego ekspresji. Wprowadzenie dsRNA do komórek ssaków, powoduje silną odpowiedź przeciwwirusową, nie wywołując tym samym ogólnej odpowiedzi przeciwwirusowej.

sRNA

Małe RNA powstają z prekursorów, którymi są dwuniciowe RNA (dsRNA). sRNA są zbudowane z 22-26 nukleotydów. Małe RNA mogą wyciszać genu za pomocą trzech mechanizmów:

1. poprzez indukcję degradacji mRNA zawierającego komplementarną do nich sekwencję,
2. poprzez blokowanie translacji takiego mRNA
3. przez indukcję zmian w strukturze chromatyny w locus, w którym znajduje się sekwencja, do której są komplementarne.

Dwa pierwsze mechanizmy noszą nazwę wyciszanie potranskrypcyjnego PTGS (ang. posttranscriptional gene silencing), trzeci to wyciszanie transkrypcyjne TGS (ang. transcriptional gene silencing).

            Małe RNA dzieli się na dwie klasy ze względu na ich pochodzenie ich prekursorów: siRNA (ang. small interfering RNA) i miRNA (ang. microRNA). Biogeneza siRNA i miRNA ma wiele podobnych etapów. Oba rodzaje sRNA są wycinane z dwunicowych prekursorów (dsRNA i pre-miRNA). Enzymy biorące udział w procesie należą do grupy RNAz III i noszą nazwę Dicer. Dwuniciowy siRNA włączany jest do kompleksu RISC (ang. RNA-iduced silecing complex), w którym następuje usunięcie nici sensownej. Kompleks z nicią sensowną odnajduje komplementarny mRNA i ułatwia wytworzenie dwuniciowego fragmentu między nim a siRNA. Całkowita komplementarność siRNA i mRNA, powoduje katalityczne cięcie i degradację mRNA, Komplementarność częściowa wywołuje zablokowanie translacji.

            Prekursory miRNA są początkowo cięte w jądrze na krótsze fragmenty przez RNAzę II zwaną Drosha. Powstałe miRNA tworzą kompleksy typu RICS zdolne do wyciszania ekspresji genów. miRNA mogą tworzyć także podobn kompleksy RITS (ang. RNA-induced initiation of transcriptional gene silecing), co indukuje modyfikacje histonów i DNA.

siRNA i miRNA są wycinane ze swych prekursorów (dsRNA, pre-miRNA) za pomocą enzymu o aktywności RNA-zy III o nazwie Dicer. siRNA jest następnie włączany do kompleksu siRISC (RNA-induced silencing complex) gdzie następuje degradacja nici sensownej. Nić antysensowna RNA połączone z RISC odnajduje komplementarny do siebie odcinek RNA i łączy się z nim. Jeśli RNA z kompleksu z RISC są do siebie w całości komplementarne następuje degradacja RNA, jeśli natomiast komplementarność jest tylko częściowa RNA zostaje zachowany i następuje blokowanie translacji. 

miRNA również powstaje jako produkt nukleazy Dicer, jednak przed tym, jego prekursor jest cięty RNaząIII (Drosha) na mniejsze fragmenty, z których Dicer wycina miRNA. miRNA podobnie jak siRNA łączy się w kompleks rybonukleinoproteinowy RISC lub inny zwany RITS (RNA-inducet initiation of transcriptional gene silencing). miRNA w kompleksie z RISC podobnie jak siRNA jest zdolne do wyciszania genów. Ponieważ nie ma 100% homologii do docelowej nici RNA więc nie powoduje jego degradacji. miRNA w kompleksie z RITS indukuje zmianę w chromatynie w kierunku jej nieaktywnej wersji -heterochromatyny. 

W komórkach człowieka RISC jest dużym wieloskładni­kowym zespołem białek, którego aktywność warunkuje obecność białka Ago-2 należącego do rodziny Argonaut. Wszystkie białka Argonaut zawierają domeny: PAZ, MID i PIWI. Domena PIWI wykazuje wysoki stopień homolo­gii do RNazy H. Pozostałe domeny odgrywają rolę w wią­zaniu nici mi/siRNA wchodzącej do kompleksu efektoro­wego. W aktywnym kompleksie RISC może uczestniczyć tylko jedna z nici siRNA, o wyborze której decyduje stabil­ność par zasad na końcach dupleksów. Nić, której koniec 5' jest mniej stabilny termodynamicznie zostaje związana z białkiem Ago-2 i aktywnie pośredniczy w procesie wy­ciszania transkryptu docelowego genu, podczas gdy dru­ga nić oddysocjowuje od kompleksu. Włączona w kompleks RISC pojedyncza nić mi/siRNA pełni funk­cję „przewodnika", dzięki któremu zachodzi identyfikacja komplementarnej sekwencji w obrębie rejonu 3' niepodle­gającego translacji - 3' UTR (3' untranslated region) nici mRNA. W przypadku pełnej komplementarności mRNA z nicią mi/siRNA faworyzowane jest bezpośrednie endo­nukleolityczne cięcie docelowego transkryptu generowa­ne między miejscami sparowania z 10. i 11. nukleotydem mi/siRNA licząc od końca 5'. W wyniku działania endo­nukleazy powstają dwa fragmenty mRNA, z których każdy jest podatny na trawienie 3'- lub 5'-egzonukleazą. W ko­mórkach zwierzęcych, gdzie niekompletne sparowanie za­sad między nicią si/miRNA włączoną do kompleksu RISC a docelowym mRNA jest w zasadzie regułą, dochodzi do zahamowania translacji danego transkryptu bez jego de­gradacji.

Ryc 1. Biogeneza miRNA

Możliwości terapeutyczne 

Postęp wiedzy na temat udziału mikroRNA w procesach chorobowych jest punktem wyjścia badań nad strategiami terapeutycznego wykorzystania mikroRNA, zarówno jako leków, jak i celów dla terapii. Chociaż większość badań jest obecnie w początkowej fazie, niektóre wstępne wyniki wydają się bardzo obiecujące. Głównym założeniem zastosowania mikroRNA w leczeniu jest uzyskanie wpływu na kontrolę ekspresji białek. Istnieje wiele doniesień wskazujących na możliwość pośredniej modyfikacji ekspresji białek zaangażowanych w patogenezę różnych chorób, w tym nowotworów za pomocą mikroRNA. Wykazano na przykład, że wprowadzenie do mikroRNA-125b mutacji typu knockdown powoduje ograniczenie proliferacji linii komórkowych raka prostaty PC-3 oraz komórek raka szyjki macicy HeLa. Jedną z potencjalnych strategii terapeutycznego wykorzystania mikroRNA jest synteza sztucznych (ang. artificial) mikroRNA komplementarnych do mRNA określonego genu. W tym układzie zadaniem syntetycznego mikroRNA byłoby wyciszenie ekspresji genu istotnego dla rozwoju lub progresji określonej choroby. Istnieją dość liczne doniesienia sugerujące potencjalną skuteczność takiej strategii. Wykazano, iż transfekcja plazmidu pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-based zawierającego sztucznie zaprojektowany pre-mikroRNA przeciwko receptorowi chemokinowemu CXCR4 do hodowli komórek raka piersi MDA-MB-231 powoduje obniżenie ekspresji CXCR4 o blisko 100% oraz w efekcie, zahamowanie migracji komórek nowotworowych. 

Inną strategią terapeutyczną związaną z mikroRNA są próby stosowania tzw. antagomirów. Termin antagomir (inaczej oligonukleotyd anty-mikroRNA, AMO), oznacza syntetyczny oligonukleotyd komplementarny do określonego mikroRNA. Idea leczenia antagomirami polega na modyfikacji aktywności określonych białek, pośrednio, poprzez wyciszenie genów mikroRNA regulujących ich ekspresję. Spektakularnym przykładem skuteczności takiej terapii są badania in vivo nad wpływem antagomiru antymikroRNA-122 na poziom cholesterolu u myszy. W tym doświadczeniu spadek poziomu mikroRNA-122 wystąpił trzy dni po iniekcji anty-mikroRNA-122. Obserwowano również obniżenie ekspresji genów regulowanych przez mikroRNA-122, w tym genów kodujących enzymy szlaku biosyntezy cholesterolu, oraz obniżenia osoczowego stężenia cholesterolu o 40%, które utrzymywało się przez dwa tygodnie od podania leku. W doświadczeniu tym cząsteczka antagomiru została w odpowiedni sposób zmodyfikowana w celu uzyskania stabilności i oporności na działanie endonukleaz komórkowych.

Odkrycie naturalnego, specyficznego zjawiska interferen­cji RNA miało istotny wpływ na rozwój badań klinicznych. Obszerne dowody potwierdzają udział cząsteczek miRNA w regulacji procesów patologicznych, w tym chorób no­wotworowych. Proces interferencji RNA ma duży po­tencjał terapeutyczny zarówno w diagnostyce, jak i te­rapii celowanej. Niemniej skuteczne wykorzystanie możliwości tego procesu w przyszłości zależy głównie od postępu w dziedzinie systemów dostarczania leków.

Pismiennictwo:

Cieplucha A., Jamroziak K., Robak T. Perspective on the role of microRNA in the therapy of cancer. Acta Haematologica Polonica 2007, 38, Nr 4, str. 425–435

Jóźwiak P., Lipińska A. RNA interference as a potential tool for diagnosis and therapy of some human diseases Postepy Hig Med Dosw. 2010; 64: 504-512

Winter P.C., Hickey G.I., Fletcher H.L. Genetyka. Krótkie wykłady (wydanie II) PWN 2009

Bal  J. Biologia molekularna w medycynie PWN 2007

Sledz C. A., Bryan R. G. RNA interference in biology and disease Blood 2005 106: 787-794.

Lu P. Y. et al. Harnessing in vivo siRNA delivery for drug discovery and therapeutic development Drug Discovery Today 2006 11(1-2):67-73.

Griffiths-Jones S. The microRNA Registry Nucleic Acids Res. 2004 32:D109-111.

Red. Blanka Majda