J. Bazan¹

¹Akademia Medyczna we Wrocławiu, Katedra  i Zakład Biochemii Lekarskiej,50-368 Wrocław, ul.Chałubińskiego 10

Ponieważ bakteriofagi w dużej mierze wykorzystują metabolizm swojego gospodarza w procesie namnażania, komórki bakteryjne muszą być w odpowiedniej kondycji (najlepiej w fazie wzrostu) oraz muszą mieć zapewnione odpowiednie warunki fizyko-chemiczne [1].

Sposób namnażania bakteriofagów w ogólnym zarysie wykazuje szereg podobieństw do sposobu namnażania wirusów eukariotycznych. W obu przypadkach występują takie etapy jak: adsorpcja, oddzielenie kwasów nukleinowych od białek, ekspresja i replikacja kwasów nukleinowych, składanie wirionów oraz ich uwolnienie i przenoszenie. Jednak jest też sporo różnic. Adsorpcja faga przebiega w dwóch etapach. W pierwszym etapie następuje adsorpcja do powierzchni komórki, jest to proces odwracalny. W drugim etapie następuje nieodwracalne wiązanie pomiędzy białkami faga i receptorem bakteryjnym. Następnie, głównie za sprawą enzymów bakteriofagowych, ściana komórkowa zostaje rozerwana w miejscu adsorpcji, a kwas nukleinowy zostaje wstrzyknięty do wnętrza bakterii, pozostawiając kapsyd poza gospodarzem (u większości bakteriofagów).

Po iniekcji materiał genetyczny bakteriofaga zostaje zintegrowany z genomem bakteryjnym (cykl lizogenny) lub pozostaje w cytoplazmie, gdzie następuje ekspresja genów, synteza białek kapsydu i ogonka, replikacja kwasu nukleinowego i składanie kompletnych wirionów. Począwszy od adsorpcji bakteriofaga, aż po lizę komórki trwa okres latencji (uśpienia). Jego długość nie jest stała i zależy od środowiska oraz od rodzaju oddziaływań fag-bakteria.Tworzenie się dojrzałych cząstek wirusowych nazywa się eklipsą. Następnym etapem jest liza komórki gospodarza i uwolnienie wirionów[2].

Bakteriofagi mogą namnażać się w kilku cyklach rozwojowych tj. cykl lityczny, lizogenny, pseudolizogenny lub powodując chroniczną infekcję, mogą również być uwalniane z bakterii przez pączkowanie.

Adsorpcja

Jak wspomniano adsorpcję można podzielić na dwa etapy, z których pierwszy, odwracalny, często wykorzystuje inne niż w etapie nieodwracalnym struktury powierzchniowe bakterii [3].

Adsorpcja jest początkowym etapem w cyklu rozwojowym bakteriofagów, a dzięki łatwej obserwacji tego zjawiska jest ono dość dobrze poznane. Prawidłowy przebieg tego procesu jest niezbędny do dalszego rozwoju wirusa wewnątrz gospodarza. Ze względu na charakter oddziaływań pomiędzy receptorem bakteryjnym a bakteriofagiem, duże znaczenie dla prawidłowego przebiegu adsorpcji ma siła jonowa środowiska, w którym zachodzi proces. Niekorzystne stężenie jonów może osłabić lub całkowicie uniemożliwić adsorpcję. Także obecność przeciwciał lub białek wiążących się z receptorami wpływa niekorzystnie na wiązanie się bakteriofaga. Adsorpcja, ze względu na swoją specyficzność, ma kluczowe znaczenie dla możliwości rozwoju danego faga w gospodarzu, a pojedyncza mutacja w genach kodujących receptor bakteryjny może powodować utratę zdolności do adsorpcji danego faga, często nie powodując różnic w możliwościach adsorpcyjnych bakteriofagów pokrewnych. Niektóre bakteriofagi do prawidłowego przebiegu adsorpcji wymagają obecności kofaktorów tj. kationy, aminokwasy i ich pochodne. Przykładem może być bakteriofag specyficzny dla bakterii typu coli (colifag) T4, który wymaga obecności tryptofanu. Tryptofan reaguje odwracalnie z fagiem zmieniając go z formy niezdolnej do adsorpcji w formę przechodzącą ten proces z dużą wydajnością. Substancją hamującą ten proces jest indol. Ponieważ bakterie E. coli mogą przekształcać tryptofan w indol, mogą również kontrolować i zapobiegać infekcji [1]. Regulację adsorpcji powinno rozważać się indywidualnie dla każdego układu fag-bakteria, gdyż czynniki wspomagające adsorpcję w jednych układach mogą ją całkowicie hamować w innych.

Badania nad kinetyką powyższego procesu wykazały, że jest to reakcja pierwszego rzędu. Oznacza to, że szybkość adsorpcji jest wprost proporcjonalna do stężenia zarówno wirusa jak i bakterii. W warunkach laboratoryjnych, w których przeprowadza się hodowle bakteryjne i namnażanie bakteriofagów, można przyjąć, że każde zderzenie się bakteriofaga z bakterią kończy się adsorpcją [4]. Dlatego też, dla optymalnego przebiegu procesu, nie jest konieczne używanie nadmiaru bakteriofaga w stosunku do infekowanych komórek.

Mechanizm infekcji – penetracja

Wirusy prokariotyczne wykorzystują różne strategie, by przenieść własną informację genetyczną do cytoplazmy komórki bakteryjnej. By osiągnąć cel musiały one wytworzyć systemy pozwalające na pokonanie naturalnych barier bakteryjnych jakimi są ściana oraz błona komórkowa, a także w wielu bakteriach dodatkowa otoczka. Większość znanych bakteriofagów to bakteriofagi ogonkowe. Ogonek pozwala im na specyficzne rozpoznawanie receptorów bakteryjnych, a także na wstrzyknięcie własnego materiału genetycznego do cytoplazmy bakterii (dzięki obecności kurczliwych białek). Bakteriofagi dsDNA, które nie posiadają ogonka posiadają specjalne struktury umożliwiające wstrzyknięcie materiału genetycznego. Niektóre bardzo nieliczne bakteriofagi wnikają w całości do komórki gospodarza, a inne wiążą się z rzęskami i wiciami bakterii [3].

Bakterie można podzielić na dwie podstawowe grupy: Gram-dodatnie i Gram-ujemne. Obie grupy różnią się znacznie w budowie i układzie warstw zewnętrznych, jednak podstawową, z punktu widzenia bakteriofagów, różnicą między tymi grupami jest grubość warstwy peptydoglikanu oraz jego usieciowanie, które jest znacznie większe w bakteriach Gram-dodatnich, oraz występowanie dodatkowej zewnętrznej błony oraz LPS (lipopolisacharydu) u bakterii Gram-ujemnych.

Po nieodwracalnej adsorpcji bakteriofag musi przetransportować swój materiał genetyczny do wnętrza komórki. Zewnętrzne otoczki polisacharydowe, często odpowiadające za pierwszy kontakt faga z bakterią, degradowane są przez specyficzne dla danych sacharydów enzymy. Warstwy peptydoglikanu stanowią poważną przeszkodę dla wirusów. Bakteriofagi atakują ścianę komórkową przerywając jej ciągłość, jednak w taki sposób by trwale jej nie uszkodzić (kanały zostają zamknięte po ok 2 min [5]).

Bakteriofagi ogonkowe posiadają podwójny system lityczny składający się z hydrolazy peptydoglikanu (endolizyna), która atakuje mureinową część ściany komórkowej oraz holiny, która jest odpowiedzialna za degradację błony cytoplazmatycznej, ułatwiając endolizynie dostęp do peptydoglikanu [6].

 Dla wirusów specyficznych w stosunku do bakterii Gram-ujemnych poznano szereg systemów enzymatycznych opartych na hydrolazach peptydoglikanu. Enzymy wykorzystywane przez te fagi mogą być częścią struktury ogonka, wyeksponowanymi na zewnątrz wirionu lub mogą być obecne wewnątrz wirusa. Colifagi T4 i P22 posiadają hydrolazy peptydoglikanu właśnie w ogonkach, T7 i PRD1 posiadają układ dwóch transglikozylaz, jedna obecna jest wewnątrz główki, natomiast druga umiejscowiona jest w wewnętrznej błonie. Bakteriofag Φ6 specyficzny dla Pseudomonas syringae zawiera w nukleokapsydzie endopeptydazy [3].

Bakteriofagi bakterii Gram-ujemnych muszą także pokonać zewnętrzną i cytoplazmatyczną błonę komórkową. Bakteriofag T4 wywiera swoim ogonkiem nacisk na błonę zewnętrzną, tak, że dochodzi do zbliżenia się jej z błoną cytoplazmatyczną, czego konsekwencją jest fuzja błon.

Badając faga T5, odkryto, że w jego ogonku tworzy się kanał przekłuwający wszystkie warstwy, które musi pokonać genom fagowy, który zostaje „wstrzyknięty” do komórki. Bakteriofag fd tworzy pory w zewnętrznej membranie, co indukuje wytwarzanie analogicznych porów w błonie cytoplazmatycznej już przez samą komórkę. Natomiast w przypadku bakteriofaga λ różne kanały w obu błonach wytwarzane są przez białka membranowe komórki gospodarza.  (Rysunek 1) [5].

Rysunek 1. Strategie przenoszenia materiału genetycznego bakteriofaga do wnętrza bakterii Gram-ujemnej. (A) Bakteriofag indukuje fuzję membran (np. T4). (B) Białka ogonka tworzą kanały przekłuwające ścianę i błony komórkowe ( np. T5). (C) Bakteriofag tworząc kanał w błonie zewnętrznej indukuje powstawanie kanału w błonie cytoplazmatycznej (np. fd). (D) Fag wykorzystuje kanały wytworzone przez bakterię (np. λ). W oparciu o źródło [5]

Dla wirusów specyficznych w stosunku do bakterii Gram-dodatnich bardzo gruba warstwa peptydoglikanu stanowi poważną barierę. Jest to jednym z powodów, dla których systemy enzymatyczne tych wirusów są słabiej zbadane. Włókna ogonka bakteriofaga Tuc2009 infekującego Lactobacillus lactis oraz białko 17 bakteriofaga P68 (infekującego Staphylococcus aureus)posiadają aktywność hydrolazy peptydoglikanu [3].

Także mechanizmy przechodzenia przez błonę cytoplazmatyczną u bakteriofagów bakterii Gram-dodatnich są słabiej poznane. Jedyny szczegółowy model został zaproponowany dla faga Bam35 infekującego Bacillus thuringiensis. W tym przypadku wewnętrzna błona kapsydu jest przekształcana w strukturę tubularną. Ta przypominająca ogon struktura przechodzi przez warstwę peptydoglikanu, po uprzednim strawieniu tej warstwy przez dwa enzymy lityczne i uczestniczy w przenoszeniu genomu przez błonę cytoplazmatyczną [7].

Cykle rozwojowe bakteriofagów

Wszechobecność bakteriofagów oraz konieczność dostosowania się do różnych gospodarzy wymusiły rozwój różnych możliwości replikacji.

Pierwsze wyizolowane przez Tworta i d’Hérelle bakteriofagi zostały opisane jako wirusy lityczne. W 1921 roku, Bordet, Ciuca i Gildmeister odkryli bakterie zdolne do wytwarzania bakteriofagów, dostarczając pierwszego dowodu na obecność cyklu lizogennego. Lwoff po zapoznaniu się z tym odkryciem sformułował określenia pseudolizogenia i lizogenia. Zdolność bakteriofagów do wywoływania chronicznej infekcji została odkryta wiele lat później [8].

W cyklu litycznym (wirulentnym) bakteriofag po wniknięciu do komórki gospodarza zmienia jego metabolizm dostosowując go do swoich potrzeb. W cyklu lizogennym genom wirusowy pozostaje „uśpiony” w tzw. stadium profaga i replikuje się wraz z genomem gospodarza, do momentu indukcji cyklu litycznego. Chroniczna infekcja występuje, gdy zakażona komórka uwalnia cząstki wirusowe bez lizy bakterii np. podczas pączkowania. W cyklu pseudolizogennym genom wirusowy pozostaje w komórce, jednak nie ulega on integracji z genomem bakteryjnym. Wiele genomów bakteriofagowych na tym etapie zaczyna pełnić rolę plazmidów, zmieniając fenotyp bakterii [2].

Cykl lityczny

Po wniknięciu materiału genetycznego faga litycznego do cytoplazmy natychmiast zaczyna się replikacja i ekspresja genów. Początkowo bakteriofag „przeprogramowuje” komórkę gospodarza. Bakteria hamuje własną replikację, transkrypcję i translację, a rozpoczyna syntezę bakteriofagowego materiału genetycznego i białek. W pierwszym stadium powstają białka należące do grupy białek wczesnych. Do tej grupy należą głównie enzymy odpowiadające za syntezę DNA i NTP (trójfosforany nukleotydów). W następnej fazie nazywanej pośrednią syntezowane są białka strukturalne m.in. białka kapsydu. W ostatniej fazie - późnej ma miejsce składanie wirionów i upakowywanie materiału genetycznego wewnątrz kapsydu. Wymienione powyżej procesy składają się na fazę dojrzewania wirionów. Następnym etapem jest uwolnienie fagów. Duża ilość cząstek wirusowych wewnątrz komórki powoduje znaczny wzrost ciśnienia osmotycznego, co wraz z osłabieniem ścian komórkowych przez odpowiednie enzymy powoduje lizę komórki [4].

Większość fagów litycznych wykorzystuje endolizyny i holiny by zniszczyć ścianę komórkową i uwolnić wiriony. Jednak niewielkie bakteriofagi, takie jak Qβ, i niektóre fagi ssDNA są zbyt małe by móc zawierać własny enzym lizujący. Wytworzyły one więc inną strategię osłabiania ściany komórkowej, wytwarzając białka, które osłabiają ścianę przez inhibicję szlaków jej syntezy [8].

Cykl lizogenny

Bakteriofagi lizogenne (łagodne) mogą przechodzić cykl lityczny, jednak najczęściej integrują one swój genom z genomem gospodarza, po czym zachodzi ekspresja wszystkich istotnych dla podtrzymania lizogenii genów. Bakteriofag w tym stadium określa się mianem profaga. Profag jest replikowany pasywnie wraz z genomem bakteryjnym i przekazywany komórkom potomnym [8].

Korzyści dla profaga płynące z przechodzenia cyklu lizogennego są ogromne.Nie musi on szukać nowego gospodarza, może wykorzystywać metabolizm bakterii oraz jej system naprawczy i jest on chroniony przed niekorzystnymi warunkami środowiska. Oczywiście profag pomaga swojemu gospodarzowi zwiększając jego odporność na superinfekcje przez inne fagi, czy wprowadzając geny, dzięki którym możliwe jest zasiedlanie przez bakterie nowych środowisk. Najczęściej bakteriofag „decyduje się” na przejście do cyklu litycznego, gdy jego gospodarz zaczyna umierać. Wpływ na przejście do cyklu litycznego mają takie czynniki jak temperatura, promieniowanie słoneczne czy stężenie jonów oraz związków chemicznych (np. pestycydów) [2].

Cykl pseudolizogenny

Pseudolizogenia jest dość zagadkowym cyklem rozwojowym. Wraz z nim pojawia się równowaga pomiędzy komórkami gospodarza a fagiem. Może to wynikać zarówno z wyrównanych ilości wrażliwych i opornych na zakażenie bakterii jak i z wyrównanych ilości fagów litycznych i niepowodujących nagłej lizy. Wysnuto także hipotezę, że bakteriofag przechodzi cykl pseudolizogenny, wtedy, gdy z powodu nieodpowiednich warunków (stężenie jonów, niedobór składników odżywczych) nie może przejść cyklu litycznego lub lizogennego. Jednak dalsze badania nad tym zagadnieniem wykazały, że dla części z poznanych bakteriofagów hipoteza ta jest nieprawdziwa  [2].

Bakteriofagi pseudolizogenne wywołują ciągłą infekcję, w której ekspresja genów zachodzi tylko w części populacji (przechodzą one do cyklu litycznego). Część z tych bakteriofagów może także przekształcić się w bakteriofagi o charakterze plazmidów. Podstawową różnicą między tym cyklem, a cyklem lizogennym jest brak integracji genomu bakteriofaga z genomem gospodarza. Natomiast cechą odróżniającą cykl pseudolizogenny od litycznego jest fakt, iż nie wszystkie zainfekowane komórki ulegają lizie [8].

Chroniczna infekcja oraz emisja faga

Podczas chronicznej infekcji dojrzałe wiriony są uwalniane z komórki bakteryjnej nie powodując lizy. Proces ten charakteryzują także mniejsze ilości uwalnianych do środowiska wirionów, niż w przypadku cyklu litycznego.

Etap emisji, nazywany również wyszukiwaniem gospodarza, kończy każdy cykl. Jest to prawdopodobnie najdłużej trwający etap w cyklu rozwojowym bakteriofagów. Większość bakteriofagów nie kończy tego etapu i ginie, nie znalazłszy odpowiedniego gospodarza. Ponieważ bakteriofagi nie posiadają narządów ruchu, przemieszczają się one jedynie dzięki ruchom występującym w środowisku ich bytowania (dyfuzja, ruchy Browna, prądy konwekcyjne i morskie itp.) [8]. 

Wszystkie opisane cykle przedstawiono schematycznie na Rysunku 2.

Rysunek 2. Schematycznie przedstawione cykle rozwojowe bakteriofagów.

 Na podstawie źródła [8].

literatura:

[1] Adams, M.H., Bacteriophages, Interscience publishers INC., New York, 1959

[2] Weinbauer M. G. Ecology of prokaryotic viruses. FEMS Microbiol. Rev., 2004, 28, 127-181

[3] Vinga, I., Sao-Jones, C., Tavares, P.,Santos, M.A., Bacterophage entry in the host cell, w G. Węgrzyn (red.), Modern bacteriophage biology and biotechnology. Research Signpost, Trivandrum, India, 2006

[4] Jawetz, E., Melnick, J.L., Adelberg, E.A., et al., Przegląd mikrobiologii lekarskiej, Państwowy Zakład Wydawnictw Lekarskich, 1991

[5] Dreiseikelmann, B., Translocation of DNA across bacterial membranes, Microbiology Review, 1994, 58, 293-316

[6] Ackermann, H.W., Tailed bacteriophages: the order Caudovirales, Adv. Virus Res., 1999, 51, 135-201

[7] Gaidelyte, A., Jaatinen, S.T., Daugelavicius, R., Bamford, J.K.H., Bamford, D.H., The Linear Double-Stranded DNA of Phage Bam35 Enters Lysogenic Host Cells, but the Late Phage Functions Are Suppressed,  Journal of Bacteriology, 2005, 187, 3521-3527

[8] Gregoracci, G. B., et al., The biology of bacteriopfages, w G. Węgrzyn (red.), Modern bacteriophage biology and biotechnology. Research Signpost, Trivandrum, India, 2006