Zdarzają się przypadki, kiedy otrzymywanie białek w postaci ciałek inkluzyjnych jest jedynym sposobem ich uzyskania. Przykładem na to może być produkcja białek toksycznych dla komórki, takich jak np. proteinazy. Dodatkowo białka w postaci nierozpuszczalnej chronione są przed degradacją proteolityczną i stosunkowo łatwo je wyizolować.

Renaturacja białek z ciałek inkluzyjnych

Otrzymywanie białek rekombinantowych poprzez ich ekspresję w E. coli, jak wspomniano powyżej, jest metodą wygodną, ekonomiczną i szybką. Ekspresja obcych genów może jednakże prowadzić do tworzenia bałek w postaci nieaktywnych i nierozpuszczalnych ciałek inkluzyjnych, szczególnie w przypadku białek szkodliwych dla komórki bakteryjnej. Zlokalizowane są one zwykle na terenie cytoplazmy, jakkolwiek białka sekrecyjne mogą tworzyć ciałka inkluzyjne w przestrzeni peryplazmatycznej (Middelberg, 2002). Każde białko do poprawnego fałdowania wymaga nieco odmiennych warunków (pH, temperatura, siła jonowa itp.), dlatego też proces odzyskiwania natywnego białka z ciałek inkluzyjnych sprawia wiele trudności i polega głównie na eksperymentalnej metodzie prób i błędów.

Izolacja i wstępne oczyszczenie ciałek inkluzyjnych

Uwolnienie ciałek inkluzyjnych z komórki zachodzi zwykle na drodze mechanicznej (sonifikacja) lub chemicznej. Tak otrzymane ciałka inkluzyjne zawierają wiele zanieczyszczeń, którymi są pozostałości zniszczonej komórki bakteryjnej. Mogą one wpływać niekorzystnie na późniejszą renaturację białka m.in. poprzez zwiększenie agregacji. Gdy mamy białka zawierające dodatkowy element np. HisTaq, GST, można przeprowadzić ich oczyszczanie po rozpuszczeniu w denaturancie. W przypadku białek bez takich elementów ich oczyszczenie po rozpuszczeniu byłoby niezwykle problematyczne, a wręcz niemożliwe. Dlatego przeprowadza się izolację ciałek inkluzyjnych przed ich rozpuszczeniem. Najczęstszą metodą usuwania zanieczyszczeń jest wirowanie, a następnie przemycie osadu buforem zawierającym detergent lub denaturant o niskim stężeniu. Takie działanie w pierwszym etapie pozwala na oddzielenie rozpuszczalnych zanieczyszczeń od nierozpuszczalnych ciałek inkluzyjnych znajdujących się w osadzie, natomiast drugi etap umożliwia usunięcie resztek błony komórkowej i białek błonowych. Takie działania pozwalają na otrzymanie białka o czystości nawet do 90%.

Rozpuszczanie

W celu rozpuszczenia ciałek inkluzyjnych stosuje się zwykle takie denaturanty jak 6-8 M chlorowodorek guanidyny lub 8 M mocznik, jak również silne detergenty takie jak SDS lub sarkozyl. Użycie denaturantów prowadzi do całkowitego rozwinięcia łańcucha polipeptydowego i utworzenia elastycznych, nieuporządkowanych struktur, natomiast stosowanie detergenta prowadzi do rozbicia częściowo sfałdowanych stanów pośrednich z jednoczesnym pozostawieniem struktur drugorzędowych. W przypadku użycia detergenta otrzymujemy zatem strukturę bardziej uporządkowaną (Gierasch i wsp., 1982), co może w konsekwencji ułatwiać późniejszą renaturację białka. Niemniej jednak tworzenie micelli może stanowić poważny problem przy próbach jego renaturacji. W celu rozpuszczenia niektórych białek korzystne jest stosowanie podwyższonej temperatury jak i buforów o skrajnych wartościach pH - poniżej 2,5 lub powyżej 12 (Gavit i Better, 2000) np. 0,1-2 M Tris pH 12.5 + 2 M mocznik.

Przy rozpuszczaniu stosuje się także często czynniki redukujące takie jak 1-500 mM DTT lub 5 mM β-merkaptoetanol (β-ME), w celu zredukowania ewentualnych mostków dwusiarczkowych oraz czynniki chelatujące takie jak EDTA lub EGTA, zapobiegające utlenianiu katalizowanemu przez jony metali.

Po rozpuszczeniu ciałek inkluzyjnych roztwór poddaje się wirowaniu w celu usunięcia elementów, które nie uległy rozpuszczeniu. W ten sposób powstaje klarowny roztwór białka. Znajdujące się w nim białko może jednakże występować w postaci oligomerów, co uniemożliwia późniejsze, poprawne fałdowanie białka. By uzyskać białko monomeryczne stosuje się często sączenie molekularne.

Renaturacja

Trzecim i zarazem sprawiającym najwięcej problemów zagadnieniem jest renaturacja białka (ang. refolding). Jest to proces polegający na przywróceniu natywnej struktury białka poprzez stworzenie warunków umożliwiających poprawne fałdowanie. Początek renaturacji ma miejsce w momencie zmniejszenia stężenia denaturanta użytego do rozpuszczenia ciałek inkluzyjnych poprzez wprowadzenie roztworu białka do odpowiedniego buforu (ang. refolding buffer). W idealnej sytuacji takie działanie powinno prowadzić do otrzymania wyłącznie natywnej struktury. Niestety renaturacja nie jest jedyną zachodzącą reakcją i współzawodniczy z takimi procesami jak niepoprawne fałdowanie (ang. misfolding) i agregacja (Tsumoto i wsp., 2003), prowadzącymi w konsekwencji do uzyskania nieaktywnego białka.

Rysunek 1. Formy łańcucha polipeptydowego podczas procesu renaturacji. NS - białko niesfałdowane, SP - stan przejściowy, SN - stan natywny.

Dane literaturowe podają, iż optymalne końcowe stężenie białka poddanego renaturacji powinno mieścić się w zakresie 10-100 g/ml (Middelberg, 2002). Przy mniejszych stężeniach wydajność renaturacji jest bardzo mała, natomiast przy większych mamy do czynienia z dużym poziomem agregacji. Problemy pojawiają się w momencie, gdy potrzeba dużych ilości natywnego białka np. w celach preparatywnych,. Po pierwsze objętość buforów do renaturacji zwiększa się w dużym stopniu, co pociąga za sobą zwiększenie kosztów. Dodatkowo odzyskiwanie białka z dużych objętości sprawia wiele trudności i jest czasochłonne. Dlatego też często w renaturacji preparatywnej stosuje się większe stężenia białka, przy czym ważne jest takie dobranie stężenia, w którym straty z powodu agregacji nie są za wysokie.

Obecnie znanych jest wiele metod zmniejszania stążenia denaturanta, czyli metod renaturacji. Należą do nich:

• dializa jednoetapowa (ang. one-step dialysis)
• dializa kilkuetapowa w buforach o zmniejszającym się stężeniu denaturanta (ang. step- wise dialysis)
• dializa jednoetapowa w buforze o malejącym stężeniu denaturanta (ang. descending denaturant concentration dialysis)
• zmiana buforów przez filtrację żelową (ang. buffer-exchange by gel filtration)
• rozcieńczenie (ang. dilution)
• odwrócone rozcieńczenie (ang. reverse dilution)
• mieszanie (ang. mixing)
• rozcieńczenie pulsacyjne (ang. pulsed dilution)
• renaturacja na kolumnie na fazie stałej (ang. solid phase refolding)

Taka różnorodność metod spowodowana jest ciągłym poszukiwaniem uniwersalnego sposobu pozwalającego na zwiększenie wydajności renaturacji.

Obecnie najbardziej obiecującą i coraz częściej stosowaną metodą jest renaturacja na kolumnie na fazie stałej. Polega ona na związaniu zdenaturowanego białka do złoża np. kolumny ze skompleksowanym Ni lub kolumny jonowymiennej. Zmniejszanie stężenia denaturanta zapoczątkowuje renaturację. Dużą zaletą tej metody jest to, iż związanie białka do złoża zmniejsza ryzyko agregacji, natomiast wadą możliwość związania białka w wielu miejscach (ang. multivalent binding) co może wręcz uniemożliwić poprawne fałdowanie białka. W takim przypadku pomocne jest stworzenie warunków, w których cząsteczka białka fluktuuje pomiędzy stanem związanym, a niezwiązanym ze złożem, jednocześnie fałdując się.

Rysunek 2. Renaturacja na kolumnie. A - wielokrotne wiązanie białka do złoża prowadzące do złego sfałdowania cząsteczki; B - jednokrotne związanie cząsteczki białka ze złożem prowadzące do powstania natywnej cząsteczki.

Ciekawą odmianą powyższej metody jest stosowanie kolumn wypełnionych złożem z immobilizowanymi cząsteczkami ułatwiającymi fałdowanie np. złoże agarozowe z immobilizowanymi cząsteczkami GroEL (ang. chapperone activity).

• Zwiększenie wydajności renaturacji osiąga się poprzez dodanie do buforów renaturujących związków niskocząsteczkowych. Mają one na celu zmniejszenie stopnia agregacji bądź stabilizację cząsteczki białka.

W przypadku niektórych białek na proces ich fałdowania mają wpływ inne białka, bądź peptydy. Dlatego czasami do buforów renaturujących wprowadza się takie elementy. Przykładem może być renaturacja karboksypeptydazy Y (CPY) z Saccharomyces cerevisiae, gdzie dodanie propeptydu CPY (CPYPR) zwiększało otrzymywaną ilość natywnego białka.

Obecnie dostępny jest test produkowany przez firmę Hampton Research,USA o nazwie "FoldIt". Powstał on na bazie buforów wykorzystywanych do krystalizaji. Pozwala on na ustalenie związków wpływających na poprawę wydajności renaturacji danego białka, jednakże opracowanie optymalnych stężeń poszczególnych składników buforu renaturującego oraz wybór metody renaturacji nadal leży w gestii indywidualnych badaczy.

Podsumowanie

System produkcji białek rekombinantowych w E. coli ze względu na łatwą hodowlę, indukcyjność i możliwość produkcji dużych ilości "obcych" białek jest powszechnie stosowany. Ciekawym sposobem jest produkcja kilku białek rekombinantowych jednocześnie, w jednej komórce gospodarza. Możliwe jest to dzięki wykorzystaniu specjalnych plazmidów do koekspresji np. plazmid pETDuet lub pACYCDuet, które pozwalają na ekspresję do czterech różnych białek. Istnieją oczywiście ograniczenia wykorzystania E. coli.

Piśmiennictwo:

K. Maziarka „Ekspresja białek rekombinantowych w bakteriach Escherichia coli - problem ciałek inkluzyjnych” Zakład Biofizyki Obliczeniowej i Bioinformatyki Wydział Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii, Uniwersytet Jagielloński

F. Gołębiowski „Ewolucja ukierunkowana białek - Tworzenie i optymalizacja funkcji białek”

Hahm M.S. i Chung B.H. „Refolding and purification of yeast carboxypeptidase Y expressed as inclusion bodies in Escherichia coli. Protein Expression and Purification” 22, 101-107 (2001)

J.Gołąb, M. Jakóbisiak, W.Lasek „Immunologia”, Wydawnictwo PWN, Warszawa 2002

red. Blanka Majda