„Od kiedy Edward Jenner w udowodnił, że kobiety mające kontakt z wirusem krowianki nie chorują na ospę prawdziwą rozpoczęła się nowa era w walce o zdrowie ludzi i zwierząt- era szczepień ochronnych.
Organizm ludzki nabył w toku ewolucji szereg sposobów walki z atakującymi go patogenami. Najważniejszym elementem obrony organizmu jest układ immunologiczny, który przez swoje mechanizmy efektorowe stoi na straży zdrowia i dobrej kondycji organizmu. Po kontakcie z patogenem zapoczątkowywana jest cała kaskada reakcji mająca na celu jego zneutralizowanie. Istnieje umowny podział odpowiedzi immunologicznej na nieswoistą i swoistą. Nieswoista jest pierwszą linią obrony i ma na celu zniszczenie wirusa, bakterii bądź pasożyta bez dokładniejszego jego identyfikowania. W skład tego rodzaju odpowiedzi wchodzą komórki żerne, lizozym i układ dopełniacza. Odpowiedź swoista rozwija się wolniej i jest skierowana przeciwko konkretnemu patogenowi i również ma na celu jego wyeliminowanie. Kolejnym podziałem odpowiedzi immunologicznej jest podział na odpowiedź komórkową i humoralną. Z odpowiedzą typu humoralnego związane są przeciwciała skierowane bezpośrednio przeciwko konkretnemu antygenowi. Odpowiedź ta rozwija się najczęściej w przypadku pasożytów i bakterii zewnątrzkomórkowych. W skład odpowiedzi komórkowej wchodzą głównie limfocyty T, które bezpośrednio reagują z obcymi antygenami. Podział odpowiedzi na humoralną i komórkową jest umowny, gdyż oba te mechanizmy współdziałają ze sobą, a antygeny z reguły wywołują oba typy odpowiedzi, choć często z przewagą jednej bądź drugiej. To, które mechanizmy efektorowe (humoralne czy komórkowe) zostaną uruchomione po kontakcie z antygenem zależy głównie od samego antygenu, ale i od sposobu jego podania, a także od predyspozycji osobniczych, gdyż dwa osobniki tego samego gatunku mogą zareagować inaczej.”
,br.
- Odporność nieswoista.
- Odporność swoista, pamięć immunologiczna.
- Stężenie przeciwciał podczas pierwotnej i wtórnej odpowiedzi immunologicznej.
- Jak działa szczepionka?
- Podział szczepionek
- Umowny podział szczepionek
- Szczepionki nowej genracji
- Oparte o rekombinowane antygeny
- Odwrotna wakcynologia
- Odwrotna wakcynologia i krok dalej
- Szczepionki DNA
- Parametry poszczególnych szczepionek nowej generacji
- Schemat działania szczepionki DNA
- Podsumowanie
Od kiedy Edward Jenner w udowodnił, że kobiety mające kontakt z wirusem krowianki nie chorują na ospę prawdziwą rozpoczęła się nowa era w walce o zdrowie ludzi i zwierząt- era szczepień ochronnych.
Organizm ludzki nabył w toku ewolucji szereg sposobów walki z atakującymi go patogenami. Najważniejszym elementem obrony organizmu jest układ immunologiczny, który przez swoje mechanizmy efektorowe stoi na straży zdrowia i dobrej kondycji organizmu. Po kontakcie z patogenem zapoczątkowywana jest cała kaskada reakcji mająca na celu jego zneutralizowanie. Istnieje umowny podział odpowiedzi immunologicznej na nieswoistą i swoistą. Nieswoista jest pierwszą linią obrony i ma na celu zniszczenie wirusa, bakterii bądź pasożyta bez dokładniejszego jego identyfikowania. W skład tego rodzaju odpowiedzi wchodzą komórki żerne, lizozym i układ dopełniacza. Odpowiedź swoista rozwija się wolniej i jest skierowana przeciwko konkretnemu patogenowi i również ma na celu jego wyeliminowanie. Kolejnym podziałem odpowiedzi immunologicznej jest podział na odpowiedź komórkową i humoralną. Z odpowiedzą typu humoralnego związane są przeciwciała skierowane bezpośrednio przeciwko konkretnemu antygenowi. Odpowiedź ta rozwija się najczęściej w przypadku pasożytów i bakterii zewnątrzkomórkowych. W skład odpowiedzi komórkowej wchodzą głównie limfocyty T, które bezpośrednio reagują z obcymi antygenami. Podział odpowiedzi na humoralną i komórkową jest umowny, gdyż oba te mechanizmy współdziałają ze sobą, a antygeny z reguły wywołują oba typy odpowiedzi, choć często z przewagą jednej bądź drugiej. To, które mechanizmy efektorowe (humoralne czy komórkowe) zostaną uruchomione po kontakcie z antygenem zależy głównie od samego antygenu, ale i od sposobu jego podania, a także od predyspozycji osobniczych, gdyż dwa osobniki tego samego gatunku mogą zareagować inaczej.
Mechanizmy efektorowe odpowiedzi nieswoistej bardzo szybko są w stanie zareagować na obecność intruza. Dzieje się tak dzięki PAPMP (Pathogen Associated Molecular Patterns, pol. uniwersalne wzorce patogenności). Wirusy, bakterie, grzyby i pasożyty posiadają biomolekuły, które są całkowicie różne od zwierzęcych, co powoduje, że mogą być łatwo zidentyfikowane i być niejako sygnałem alarmowym, że w organizmie znajduje się patogem. Do cząsteczek tych należy np. LPS (lipopolisacharyd)- wchodzi w skład ścian komórkowych bakterii, dsRNA ( dwuniciowe RNA)- obecne tylko w cząsteczkach wirusowych, zymosan, charakterystyczny dla drożdży, kwas lipotejchojowy- charakterystyczny dla wielu bakterii. Cząsteczki, które zdolne są do rozpoznawania PAMP to tzw. Toll- podobne (ang. Toll like receptor). Scharakteryzowano szereg receptorów Toll podobnych. Mogą być to receptory wydzielnicze (po połączeniu z określonym PAMP ułatwiają fagocytozę, działają jak opsoniny). Obecne są na komórkach fagocytujących oraz na komórkach nabłonkowych (np. jamy ustnej, układu oddechowego, pokarmowego). Stanowią one pierwszą linie rozpoznania i obrony przed patogenami. Po rozpoznaniu dla siebie ligandu wydzielają chemokiny, które przyciągają do miejsca zakażenia komórki układu odpornościowego. Tu komórki układu immunologicznego ulegają aktywacji i rozpoczyna się kaskada reakcji mająca na celu zniszczenie mikroorganizmu. Często rozpoczyna się to stanem zapalnym, a mikroorganizmy mogą być zniszczone przez defensyny, wybuch tlenowy , bądź fagocytozę.
Jak już wspomniano pierwszą linią obrony organizmu przeciw patogenom jest odporność nieswoista, która działa szybko, choć niespecyficznie. Równolegle do niej rozwija się odpowiedź swoista. W organizmie krąży szereg limfocytów T oraz B, które napływają do ogniska zapalnego, a te które mają na swojej powierzchni receptory „pasujące” do antygenów mikroorganizmu zostają aktywowane i ulegają podziałom. Po takim procesie w organizmie znajdują się limfocyty posiadające receptory specyficznie rozpoznające dany patogen i po ponownym kontakcie z antygenem, komórki te są gotowe do działania i nie wymagany jest czas (jak podczas odpowiedzi pierwotnej) na „uczenie się” rozpoznawania antygenu. Po za tym w miarę upływu czasu limfocyty B proliferując ulegają mutacjom somatycznym i powinowactwo przeciwciał zwiększa się. Pamięć immunologiczna trwa całe życie [1].
Stężenie przeciwciał podczas pierwotnej i wtórnej odpowiedzi immunologicznej
Rys. 1 Stężenie przeciwciał podczas pierwotnej i wtórnej odpowiedzi immunologicznej [1 Zmodyfikowane]
Pamięć immunologiczna jest kluczowym elementem, który pozwala na konstrukcję szczepionek. Jak wcześniej wspomniano Edward Jenner zaobserwował, że kobiety mające kontakt z wirusem krowianki nie chorowały na ospę prawdziwą. Poddał chłopca z sierocińca działaniu tego samego wirusa, a następnie działaniu wirusa ospy prawdziwej ( bardzo niebezpiecznej wówczas choroby). Choć etyczny aspekt jego badań jest dyskusyjny efekty były piorunujące. Została opracowana pierwsza na świecie szczepionka. Ostatni przypadek ospy prawdziwej w Wielkiej Brytanii został odnotowany w latach 20 tych XX wieku, a na Świecie w październiku 1977 roku w Somalii.
Bakteria, wirus, czy pasożyt to setki, tysiące różnych antygenów i epitopów. Po wniknięciu do organizmu komórki układu odpornościowego uczą się je rozpoznawać i produkować specyficzne przeciwciała. Z uwagi na pamięć immunologiczną po ponownym kontakcie z patogenem mają gotowy oręż do walki z nim. Wirus krowianki jest na tyle różny od ospy prawdziwej, że nie powoduje u ludzi tych samych objawów, ale w gruncie rzeczy na poziomie molekularnym wirusy te są na tyle podobne, że mają wiele takich samych antygenów. Organizm mający kontakt z wirusem krowianki nie jest narażony na śmierć i ma czas na wytworzenie odpowiednich przeciwciał przeciwko wirusowi. Po tej ekspozycji, jeśli nastąpi kontakt z wirusem ospy prawdziwej, nie traci on czasu na „ uczenie się” rozpoznawania wirusa, ale dysponuje gotową bronią w postaci przeciwciał i receptorów limfocytów T.
Dla potrzeb niniejszego artykułu właściwe wydaje się wprowadzenie podziału na szczepionki tradycyjne i nowej generacji. Każdy rodzaj i typ tych preparatów ma swoje wady i zalety.
Szczepionki oparte o żywe organizmy zawierają pełny komplet antygenów i jest to prawie w pełni odwzorowanie infekcji drobnoustroju zjadliwego. Podanie jednej nawet dawki takiej szczepionki może powodować odporność [1]. Wyróżnia się kilka rodzajów szczepionek opartych o żywe organizmy. Do pierwszej kategorii można zaliczyć szczepionkę opracowaną przez Edwarda Jennera, który podał wirus homologiczny do wirusa zjadliwego. Można również podawać szczepy zjadliwe w jakiś sposób osłabione. Proces taki nazywamy atenuacją. W zależności od sposobu osłabiania mikroorganizmu atenuację możemy podzielić na losową lub ukierunkowaną. Ta pierwsza polega na poddawaniu mikroorganizmu czynnikom bądź warunkom stresowym, które osłabią go na tyle, że nie będzie on w stanie wywołać objawów chorobowych. Atenuacja ukierunkowana polega natomiast na konkretnym wyłączeniu genu warunkującego zjadliwość lub uniemożliwienie namnażania się mikroorganizmu. Używane są tutaj zaawansowane metody biologii molekularnej i inżynierii genetycznej w celu osiągnięci zamierzonego celu. Szczepionki oparte o martwe patogeny są nieco mniej skuteczne i z reguły potrzeba klika dawek w celu wywołania trwałej odporności. Są jednak bezpieczniejsze, gdyż całkowicie wyklucza się mutację, która spowodowałby odzyskanie zjadliwości.
|
Szczepionki tradycyjne
|
Oparte o żywe organizmy
|
|
Oparte o martwe organizmy
|
|
|
Szczepionki nowej generacji
|
Oparte o rekombinowane antygeny
|
|
Szczepionki DNA
|
|
|
Szczepionki jadalne
|
|
|
Szczepionki oparte o wektory bakteryjne bądź wirusowe |
Jakkolwiek szczepionki tradycyjne z powodzeniem spełniają swoją rolę i uratowały ludzkość od wielu cierpień, są choroby, których nie daje się wyeliminować w oparciu o ich zastosowanie. Po za tym w szczepionkach tradycyjnych podawane są żywe lub martwe patogeny, co sprawia, że organizm ludzki ma kontakt z tysiącami antygenów, co sprawia, że przewidzenie wszystkich skutków jest praktycznie niemożliwe. Największym zagrożeniem są tutaj nietolerancja osobnicza i możliwość wystąpienia reakcji alergicznych. Nowoczesne szczepionki mają składać się z jednego lub kilku antygenów dokładnie przebadanych i podanych w odpowiedni sposób. Kolejną przeszkodą, z która nie radzą sobie szczepionki tradycyjne jest czasami niemożność otrzymania materiału biologicznego na skalę przemysłową. Nastręcza to problemu głównie, jeśli chodzi o szczepionki przeciwko pasożytom, które mają skomplikowane cykle rozwojowe, jednego lub kilku żywicieli pośrednich i w przeciwieństwie do bakterii nie mogą być namażane in vitro.
Schemat uzyskiwania rekombinowanego antygenu protekcyjnego
Rys. 2. cDNA wyodrębnionego białka protekcyjnego łączone jest z DNA plazmidu ekspresyjnego w reakcji ligacji. Rekombinownay plazmid zawierający cDNA antygenu protekcyjnego wprowadzony jest do bakterii ( najczęściej E. coli). cDNA w komórkach bakteryjnych ulega transkrypcji, translacji i powstaje białko protekcyjne połączone z sześcioma histydynami. Umożliwiają one oczyszczanie białka na kolumnie z jonami niklu metodą chromatografii powinowactwa
Oparte o rekombinowane antygeny
Zasada działania szczepionek opartych o rekombinowane antygeny nie odbiega dużo od tradycyjnych. Organizm ludzki, bądź zwierzęcy immunizowany jest białkiem drobnoustroju uzyskanym metodami inżynierii genetycznej i biologii molekularnej. Co ma spowodować wytworzenie pamięci immunologicznej przeciwko temu białka i po późniejszym kontakcie z drobnoustrojem organizm ma gotową broń do walki z nim. Największym problemem do przezwyciężenia jest tutaj dobór odpowiedniego antygenu szczepionkowego. Z pośród tysięcy białek drobnoustroju wybrany musi być jeden lub kilka antygenów kluczowych dla jego życia i rozwoju. Podczas poszukiwania antygenów protekcyjnych bardzo często stosuje się biblioteki ekspresyjne cDNA [2], różnego rodzaju metody immunologiczne i biochemicze, których opisanie znacznie przekracza rozmiary tego opracowania. Po wyodrębnieniu antygenu protekcyjnego konstruowane są transgeniczne bakterie, które zawierają cDNA antygenu protekcyjnego. Bakterie te są skonstruowane w sposób umożliwiający ekspresję pożądanego białka, które połączone jest z sekwencją umożliwiającą jego oczyszczanie metodą chromatografii powinowactwa. Najbardziej standardowymi metodami są tu sprzęganie antygenu protekcyjnego z sekwencją sześciu histydyn, co umożliwia jego oczyszczanie na kolumnie z jonami niklu, który ma powinowactwo do histydyn. Drugim standardowym sposobem jest sprzężenie antygenu z białkiem wiążącym glutation- GBP ( glutathione binding protein), co umożliwia oczyszczanie go na kolumnie z glutationem.
Schemat oczyszczanie rekombinowanego antygenu protekcyjnego metodą chromatografii powinowactwa
Rys. 3. Lizat bakteryjny zawiera wiele różnych białek, w tym białka protekcyjne połączone z sekwencją 6x His. Całość zostaje nałożona na kolumnę z niklem. Wiążą się z nią tylko białka zawierające sześć histydyn. Następnie do czystej probówki, buforem o odpowiedniej sile jonowej i pH oraz o odpowiednim (eksperymentalnie dobranym stężeniem innych składników), wypłukiwane jest rekombinowane białko, które może być użyte jako szczepionka. Rysunek ma charakter uproszczony, w rzeczywistości oczyszczanie białka jest bardziej skomplikowane i zawiera więcej etapów.
Historia szczepień jest dość prosta. Na początku wykorzystano wirus podobny do bardzo patogennego dla człowieka, potem wykorzystywano organizmy atenuowane, aby w końcu osiągnąć etap szczepionek opartych o białka rekombinowane i cDNA. Te dwa ostatnie rodzaje mają ze sobą wiele wspólnego.
Kluczowym elementem jest tutaj poszukiwanie i dobór odpowiedniego antygenu szczepionkowego. Do tej pory używano metod immunologicznych, biochemicznych i biologii molekularnej. Jakkolwiek nie zawsze z sukcesem. Po za tym metody te wymagają stałego dostępu do materiału badawczego i często przeszkodą jest wykrywanie genów na niskim poziomie ekspresji. Nowatorskim podejściem jest odwrotna wakcynologia. Bazuje ona na sekwencjach genomów patogenów poznanych i zdeponowanych w internecie [3]. Rozwój bioinformatyki i algorytmów komputerowych sprawił, iż możliwe jest wyszukanie w genomie otwartych ramek odczytu (ORF, ang. open reading frame). Z wyodrębnionych ORF wybierane są te, które mogą kodować białka wydzielnicze lub powierzchniowe. Następnie postępowanie jest podobne jak w przypadku szczepionek cDNA i opartych o rekombinowane antygeny. Uzyskane zostaje rekombinowane białko w heterologicznym systemie ekspresji (pro- lub eukariotyczny), oraz przeprowadzona zostaje próba szczepionkowa z użyciem zwierząt laboratoryjnych. Oceniana również jest poprawność przewidywań in silico czy dane białko jest faktycznie powierzchniowym lub wydzielniczym.
Na znaczenie badań odwrotnej wakcynologii wskazują badania z Neisseria meningitidis - powodującą sepsę [4] Używając tradycyjnych metod opracowano szczepionkę przeciwko serotymom A, C, Y, W 35 , jednak nie przeciwko serotypowi B. Badania z użyciem metod odwróconej wakcynologiinad N. meningitidis rozpoczęto gdy genom tego patogenu nie był jeszcze w pełni zsekwencjonowany. Z pośród ok. 570 wybranych początkowo genów dających nadzieję na wyodrębnienie antygenów protekcyjnych na drodze selekcji laboratoryjnej wyodrębniono 22, których produkty były w stanie wywołać pewien typ odpowiedzi immunologicznej
Odworotna wakcynologia pozwala na wyodrębnienie antygenów protekcyjnych z reguły na bazie sekwencji jednego genomu [5]. Bakterie jednak to organizmy dość zmienne i wykazano na podstawie 7 genomów różnych szczepów Streptococcus agalactiae B(czynnika etiologicznego sepsy), że rdzeń tworzy 1806 genów, które są rdzeniem i odpowiadają głównie za funkcje metabolizmu podstawowego. Pozostałe 20% genów to geny, które zostały nabyte bądź odrzucone przy dostosowywaniu się do konkretnego środowiska zamieszkałego przez dany szczep. Wskazuje to, że aby szczepionka była poprawnie zaprojektowana czasami trzeba wziąć nie tylko pod uwagę dobór antygenu protekcyjnego, ale uwzględnić strukturę genetyczna populacji danego organizmu, gdyż może się okazać, że podczas, gdy jeden szczep jest wrażliwy na szczepionkę inny pozostaje na nią odporny [6,7,8]
Kolejnym fascynującym, choć wzbudzającym kontrowersje, sposobem wzbudzania odporności przeciwko patogenom są szczepionki z nagiego DNA. Zasada działania jest prosta: DNA (np. w formie plazmidu ) zostaje podane człowiekowi lub zwierzęciu i wnika do komórek i tam następuje ekspresja antygenu szczepionkowego. Szczepionki DNA najczęściej wzbudzają odpowiedź typu komórkowego, choć równie dobrze mogą powodować odpowiedź humoralną. Schemat działania szczepionki DNA przedstawiono na rysunku. Zależy to od samego antygenu, sposobu wprowadzenia DNA do komórek, rodzaju komórek oraz konstrukcji wektora. Aby zmienić rodzaj odpowiedzi immunologicznej, a także jej stopień możliwe jest wprowadzenie do plazmidu również cDNA np. IL 2, 12, 4, GM- CSF i wielu innych [9]. Kontrowersyjnym aspektem szczepionek jest fakt, że organizm, który pobrał DNA staje się, z punktu widzenia prawa, Organizmem Genetycznie Modyfikowanym (GMO). Mimo tego w roku 2005 wprowadzono na rynek 2 szczepionki DNA: szczepionkę przeciwko Wirusowi Zachodniego Nilu dla koni w USA i przeciwko wirusowi powodującemu chorobę łososi w Kanadzie [10] [11]. Autorzy niestety nie podają dokładnego opisu preparatów.
|
|
Oparte o białka rekombinowane
|
Oparte o atenuowane bakterie/ wirusy
|
Szczepionki DNA
|
|
Rodzaj wywoływanej odpowiedzi immunologicznej |
humoralna
|
Komórkowa lub humoralna |
Komórkowa lub humoralna |
|
Specyficzność odpowiedzi immunologicznej |
Specyficzna- przeciwko rekombniowanemu białku |
Możliwa rektywność przeciw pokrewnym mikoroorganizmom |
Specyficzna- przeciwko białkom kodowanym przez podane cDNA |
|
Bezpieczeństwo
|
Uznawana za bezpieczną |
Możliwa rewersja i odzyskanie zjadliwości |
Uznawana za bezpieczna |
|
Stabilność
|
Powinna być przechowywana jako zamrożona |
Może wymagać mrożenia |
Potencjalnie stabilna w temperaturze pokojowej |
|
Koszt
|
Relatywnie droga
|
Koszty produkcji wirusów są wysokie |
Relatywnie tania
|
[12 Zmodyfikowane]
Rys. 3 Schemat działania szczepionki DNA [12 Zmodyfikowane].
W dobie, kiedy w nauce święci podejście interdyscyplinarne do każdego aspektu badań dotyczącego zdrowia ludzi wakcynologia jako nauka nowoczesna i postępowa rozwija się niebywale szybko. Połączenie nauk biologicznych szczególnie z informatyką, bioinformatyką i metodami statystycznymi daje możliwości na opracowanie szczepionek nowej generacji, które mogą być łatwo dostępne, tanie, a przede wszystkim skuteczne. Każdy rodzaj szczepionki (tradycyjne i nowej generacji) ma swoje mocne i słabe strony. Nie opracowano jednej idealnej metody. Każda łączy się z nadziejami i wątpliwościami. Jednak badania naukowe prowadzone w licznych ośrodkach na całym świecie dają nadzieje na opracowanie skutecznych szczepionek przeciwko chorobom, z którymi, jak dotąd, ludzkość nie była w stanie sobie poradzić.
1 Gołąb J, Jakóbisiak M, Lasek W. Immunologia. 2002. Wydawnictwo Naukowe PWN.
2. Feng J, Zhan B, Liu Y, Liu S, Williamson A, Goud G, Loukas A, Hotez P. Molecular cloning and characterization of Ac-MTP-2, an astacin-like metalloprotease released by adult Ancylostoma caninum. Mol Biochem Parasitol. 2007 Apr;152(2):132-8.
3. Mora M, Veggi D, Santini L, Pizza M, Rappuoli R. Reverse vaccinology Drug Discov Today. 2003 May 15;8(10):459-64. Review.
4. Pizza M, et al. Identification of vaccine candidates against serogroup B meningococcus by whole-genome sequencing Science. 2000 Mar 10;287(5459):1816-20.
5. Mora M, Donati C, Medini D, Covacci A, Rappuoli R. Microbial genomes and vaccine design: refinements to the classical reverse vaccinology approach. Curr Opin Microbiol. 2006 Oct;9(5):532-6. Review.
6. Glaser P, Rusniok C, Buchrieser C, Chevalier F, Frangeul L, Msadek T, Zouine M, Couvé E, Lalioui L, Poyart C, Trieu-Cuot P, Kunst F Genome sequence of Streptococcus agalactiae, a pathogen causing invasive neonatal disease. Mol Microbiol. 2002 Sep;45(6):1499-513.
7. Tettelin H, et al. Genome analysis of multiple pathogenic isolates of Streptococcus agalactiae: implications for the microbial "pan-genome". Proc Natl Acad Sci U S A. 2005 Sep 27;102(39):13950-5.
8. Maione D at al Identification of a universal Group B streptococcus vaccine by multiple genome screen. Science. 2005 Jul 1;309(5731):148-50.
9. Gurunathan S., Klinman D.M., Seder R.A., DNA vaccines: immunology, application, and optimization*, Annu. Rev. Immunol. 18 (2000) 927–974.
11. Za: Foss GS, Rogne S. When gene medication is also genetic modification-regulating DNA treatment. Vaccine. 2007 Jul 26;25(30):5613-8.
12. Garmory HS, Perkins SD, Phillpotts RJ, Titball RW. 2005 DNA vaccines for biodefence. Adv Drug Deliv Rev. Jun 17;57(9):1343-61.
Piotr Bąska
Obszar badań: parazytologia molekularna, immunologia, bioinformatyka.
KOMENTARZE