Komórki macierzyste – definicja, metody pozyskiwania

Ogólnie mianem komórki macierzystej można określić komórkę mającą zdolność do samoodnawiania i różnicowania się w coraz bardziej zróżnicowane komórki potomne.

Zygota – zapłodniona komórka jajowa – jest komórką macierzystą totipotencjalną, czyli taką, z której może się rozwinąć łożysko oraz cały organizm. Kolejną w szeregu jest komórka pluripotencjalna (komórki moruli, blastocysty) dająca początek wszystkim trzem listkom zarodkowym (ektodermy, mezodermy i endodermy). Następnie powstają ukierunkowane tkankowo komórki macierzyste – unipotencjalne komórki różnicujące się tylko w jeden rodzaj tkanki.

Wykorzystywanym od dawna [2], dość łatwo dostępnym źródłem są krwiotwórcze komórki macierzyste, w ostatnich latach stosuje się także komórki macierzyste naskórka. Mezenchymalne komórki macierzyste, jak wykazano [12], oddziałują na okoliczne tkanki poprzez wydzielanie cytokin modyfikujących działanie komórek oraz wpływając pozytywnie na przeżywalność. Niestety ze względu na ograniczone możliwości różnicowania tego typu komórek oraz trudność izolacji komórek macierzystych innych narządów i tkanek m.in. wątroby czy mięśnia sercowego, prowadzone są badania nad pozyskaniem komórek pluripotencjalnych, które mogą się różnicować w różne typy tkanek. Istnieje kilka możliwych źródeł pozyskiwania komórek pluripotencjalnych.

Pierwszym z nich i zaraz najbardziej kontrowersyjnym są zarodki. Komórki macierzyste w tym przypadku pozyskuje się z blastocysty lub moruli – pozyskanie tą metodą jest jednoznaczne z brakiem zgodności tkankowej z układem HLA biorcy. Ponadto metoda ta ze względów etyczno-religijnych nie jest obecnie wykorzystywana.

Liczne kontrowersje wzbudza także tzw. klonowanie terapeutyczne, które polega na wprowadzeniu jądra komórki somatycznej do pozbawionej jądra komórki jajowej. W wyniku tego na drodze zmian epigenetycznych następuje ekspresja wczesnych rozwojowo genów – w ten sposób sklonowano słynną owcę Dolly. W tym przypadku otrzymuje się organizm identyczny pod względem genetycznym z organizmem dawcy.

Ostatnio zidentyfikowano [4] również populację bardzo małych zarodkowych komórek macierzystych (VSEL) w mysim szpiku kostnym. Komórki te należą do niehematopoetycznych komórek z wysokim stosunkiem jądro/cytoplazma oraz niezorganizowaną chromatyną i ekspresją markerów pluripotencjalnych komórek macierzystych. Wzbudzają jednak liczne dyskusje ze względu m.in. na trudność izolacji oraz różnicę w różnicowaniu np. nie są wstanie wytworzyć potworniaka, co jest cechą charakterystyczną pluripotencjalnych komórek macierzystych pochodzących z embrionów [11]. W normalnych warunkach krążą we krwi obwodowej w małej ilości, jednakże ich ilość znacznie wzrasta po stymulacji czynnikiem stymulującym wzrost granulocytów (G-CSF). Ponadto wykazano, że ich liczba zmniejsza się wraz z wiekiem. Istnieje także możliwość ich izolacji poprzez zastosowanie leukafarezy.

W badaniu [3] wykazano, że u ludzi nie obserwowano spadku stężenia krążących VSEL wraz z wiekiem, jednak odbyło się to na małej grupie osób. Ponadto w przypadku m.in. zawału mięśnia sercowego obserwowano wzrost stężenia VSEL we krwi obwodowej, którego długość korelowała z utrzymującym się niedokrwieniem. Dane te wskazują na możliwość izolacji VSEL od pacjentów, namnożenia in vitro i następnie podanie pacjentom w celach terapeutycznych.

Ciekawą alternatywą są indukowane komórki macierzyste (ind-PKM)[1] – uzyskiwane w wyniku transformacji in vitro dorosłych komórek somatycznych przy użyciu genów kodujących czynniki transkrypcyjne komórek embrionalnych (Oct-4, Nanog, Klf4, c-myc). Jest to niestety metoda trudna w użyciu, ponieważ odróżnicowanie do stanu embrionalnego udaje się tylko w jednej na kilka tysięcy komórek. Jednak problemem ind-PKM jest duża niestabilność genetyczna, występowanie aberracji chromosomowych oraz powstawanie potworniaków i odrzucanie przez organizm.

Zastosowanie pluripotencjalnych komórek macierzystych

Trudności w uzyskaniu pluripotencjalnych komórek macierzystych, a także względy etyczne spowodowały, że badania z ich użyciem są utrudnione. Komórki VSEL wzbudzają wiele kontrowersji, ponieważ ich istnienie jest szeroko dyskutowane [10,11]. Komórki VSEL wymagają licznych, dokładniejszych badań oraz usprawnienia metod ich izolacji dlatego głównym źródłem są obecnie indukowane komórki macierzyste, które ze względu na możliwość nowotworzenia mają jak na razie ograniczone zastosowanie w leczeniu. Głównie są stosowane do tworzenia modeli chorób w celu obserwacji zachowań oraz do badań działania nowych leków.

Komórki ind-PKM mają ogromne zastosowanie w poznawaniu mechanizmów chorób, ponieważ dzięki zastosowaniu struktury 3D możliwe jest nie tylko obserwowanie zachowania komórek ale i substancji międzykomórkowej, naśladując w ten sposób środowisko występujące in vivo.

Dzięki zastosowaniu w badaniach ind-PKM pobranych od pacjentów cierpiących na choroby niedoborowe [5] m.in. ciężki złożony niedobór odporności w wyniki niedoboru deaminazy adenozynowej (ADA-SCID), zespół Schwachman-Bodian-Diamond (SBDS) czy chorobę Gauchera (GD) typu III zaobserwowano, że choroby te są dziedziczone autosomalnie recesywnie zgodnie z Prawem Mendla. Ponadto zidentyfikowano, że przyczyną wspomnianych chorób są mutacje punktowe genów  odpowiadających za prawidłową hematopoezę i funkcję immunologiczną.

Stworzono także model [6] ind-PKM pobranych z pęcherza moczowego oraz prostaty, co pozwala na obserwację tych tkanek pod kątem chorób oraz nowotworów.

Tworzone są w ostatnich latach przy użyciu ind-PKM także modele wielu innych chorób [7], w tym także neurodegeneracyjnych jak choroba Parkinsona, które pozwalają lepiej zrozumieć mechanizm molekularny powstawania chorób związanych z mutacjami lub aberracjami genowymi i chromosomowymi. 

Pluripotencjalne komórki macierzyste (PKM), a także ind-PKM w ostatnich latach są celem badań dotyczących medycyny regeneracyjnej. Obecnie prowadzone są badania kliniczne I i II fazy dotyczące zastosowania PKM w leczeniu [8,9].

Badania na myszach i szczurach dowiodły ich skuteczności w regeneracji uszkodzenia rdzenia kręgowego. Podczas urazu często część komórek nerwowych  ma zachowaną ciągłość, ulegają jednak demielinizacji. Komórki macierzyste, jako prekursory oligodendrocytów mają w tym przypadku pomóc w remielinizacji włókien nerwowych, przywracając tym samym funkcję komórek nerwowych, jaką jest przesyłanie impulsów.

Trwają także badania nad wykorzystaniem PKM w chorobie Huntingtona – niestety jak do tej pory udało się tylko uzyskać czasową remisję.

Za kolejny przykład może posłużyć choroba Parkinsona, za którą odpowiedzialny jest zanik komórek dopaminergicznych w istocie czarnej. Badania na modelu zwierzęcym są obiecujące – uzyskano produkcję dopaminy oraz obniżenie zachorowanie na tę chorobę.

Obecnie trwają badania kliniczne z użyciem uzyskanych na drodze partenogenezy ludzkich embrionalnych komórek macierzystych, które można wszczepiać pacjentom razem z elektrostymulatorami i następnie obserwować i monitorować skuteczność terapii.

Istnieją także badania kliniczne nad przeszczepianiem astrocytów uzyskanych z komórek macierzystych do rdzenia kręgowego osób cierpiących na Stwrdnienie Zanikowe Boczne (ALS).

Intensywnie prowadzone są również badania nad wykorzystaniem PKM w celu leczenia chorób związanych z utratą wzroku jak np. związane z wiekiem zwyrodnienie plamki żółtej (AMD) czy choroba Stargardta. W tym celu stosowane są komórki nabłonka barwnikowego siatkówki uzyskane na drodze pobudzenia różnicowania PKM lub ind-PKM w odpowiednim kierunku, aby następnie tworząc monowarstwę na polimerowym rusztowaniu lub w postaci zawiesiny zostały przeszczepione do oka biorcy. Obecnie, podobnie jak w poprzednich przypadkach, po obiecujących wynikach badań przedklinicznych na modelach zwierzęcych trwają badania kliniczne I fazy.

Nieco inne podejście jest wykorzystywane w leczeniu cukrzycy typu I, która jest związana z destrukcją komórek β trzustki wydzielających insulinę. W tym przypadku - aby uniknąć odrzucenia wszczepionych komórek – wykorzystywane są kapsuły ochronne w kształcie przypominającym kartę kredytową, w których zamknięte są komórki β trzustki uzyskane na drodze różnicowania z PKM lub ind-PKM. Dzięki takiemu podejściu udało się uzyskać kontrolę glikemii u szczurów – w chwili obecnej trwają wieloośrodkowe badania kliniczne fazy I i II.

Embrionalne komórki macierzyste (EKM) próbuje się także wykorzystywać do przywrócenia funkcji mięśnia sercowego po zawale. Na modelach zwierzęcych udało się uzyskać wzrost kardiomiocytów w bliźnie pozawałowej, jednak wiązało się to często z arytmiami. W ostatnim czasie zastosowano progenitorowe komórki kardiomiocytów osadzone na rusztowaniu z fibryny u pacjenta z ciężką dysfunkcją lewej komory serca [9]. W 3-miesięcznej obserwacji pooperacyjnej nie odnotowano działań niepożądanych oraz uzyskano poprawę kurczliwości oraz kurczliwość w miejscu, które przez operacją wykazywało atonię.

Prowadzone są także badania w celu zastosowania ind-PKM w medycynie regeneracyjnej [7]. Poprzez pobranie i odróżnicowanie komórek chorej tkanki, naprawę ewentualnych mutacji genetycznych i następnie ponowne jej wprowadzenie do organizmu może być leczonych wiele chorób jak np. zaburzenie hematopoezy, urazy mięśniowe, uszkodzenie rdzenia kręgowego czy wątroby.

Udało się także skorygować niedobór dystrofiny odpowiedzialny ze chorobę Duchenna (DMD). W tym celu pobrano komórki mięśniowe od osoby chorej i przy użyciu technik molekularnych naprawiono uszkodzony gen.

Ciekawe są również badania dotyczące stosowanie ind-PKM krwi do wytwarzania erytrocytów. Dzięki temu byłoby możliwe pozyskanie krwi potrzebnej do leczenia wielu chorób oraz urazów przebiegających z utratą krwi.

Ind-PKM mogą pomóc w naprawie wielu uszkodzonych tkanek jak np. komórki układu sercowo-naczyniowego stosowane w celu naprawy uszkodzonych kardiomiocytów, zastawek serca. Niestety takie zastosowanie wymaga wielu badań oraz opracowania techniki dostarczania komórek do uszkodzonych tkanek.

Interesujące jest także wykorzystanie pluripotencjalnych komórek macierzystych do regeneracji komórek zawierających mutację po wcześniejszym jej usunięciu za pomocą terapii genowej i wprowadzenia prawidłowego genu do ind-PKM.

Kolejną płaszczyzną, w której znajdują zastosowanie ind-PKM jest pomoc w odkrywaniu oraz badaniu cytotoksyczności nowych leków [7]. Badania nad nową substancją hipotetycznie użyteczną w leczeniu trwają bardzo długo oraz są niezwykle kosztowne, a jedynie 10% badanych leków wchodzi w fazę badań klinicznych. Indukowane komórki macierzyste mogą w tym przypadku już na początkowych etapach badań dać odpowiedź na temat potencjalnej przydatności, toksyczności, a także metabolizmu w komórce, ponieważ badacze są wstanie dzięki nim stworzyć in vitro warunki podobne do tych panujących in vivo w danej tkance m.in. hepatotoksyczność i kardiotoksyczność, jak również wpływ na kancerogenezę.

Podsumowując, warto zauważyć, że pluripotencjalne komórki macierzyste wciąż wymagają dalszych badań zwłaszcza nad bezpieczeństwem stosowania, jednak już teraz są cennym źródłem danych, które ułatwiają pozyskiwanie nowych leków oraz leczenie indywidualne pacjenta. Przybliżają nas tym samym do coraz większego rozwoju medycyny spersonalizowanej umożliwiając dobranie leczenia pod kątem reakcji na model choroby utworzony z komórek pacjenta.

Niestety aby była możliwa terapia ind-PKM chorób genetycznych musimy udoskonalić metody terapii genowej, zwłaszcza wektory służące do wprowadzania informacji genetycznej, a także wykluczyć prawdopodobieństwo nowotworzenia w odpowiedzi na stosowane czynniki wzrostu.

Nawet w przypadku pozytywnych wyników trwających badań klinicznych I i II fazy minie jeszcze minimum kilka lat zanim jedna z metod będzie dostępna jako jedna z opcji terapeutycznych.

Łukasz Głowacki