Czym zajmuje się Pracownia Bioczujników i Mikrosystemów Analitycznych?
Prof. Dorota Pijanowska: Prowadzimy badania nad bioczujnikami i mikroukładami analitycznymi. Popyt na miniaturowe urządzenia do jednoczesnych oznaczeń kilku substancji biochemicznych bądź do badań 'przy łóżku pacjenta' (point-of-care) stale rośnie. Najistotniejsze cechy bioczujników to krótki czas odpowiedzi, niezawodność i niska cena pojedynczego oznaczenia. Aktualnie prowadzone prace badawcze dotyczą bioczujników elektrochemicznych i mikrosystemów do analiz biochemicznych.
Bioczujniki jednak to nie jest hit ostatnich lat prawda?
Najstarszym i najbardziej popularnym bioczujnikiem jest czujnik glukozy. W klasycznym ujęciu jest on zbudowany z wykorzystaniem elektrochemicznego czujnika tlenu z membraną półprzepuszczalną, na powierzchni której zachodzi reakcja enzymatyczna oksydazy glukozowej – mierzona jest konsumpcja tlenu podczas reakcji enzymatycznego utleniania glukozy. I rzeczywiście, ma pan rację, pierwszy model bioczujnika, wykorzystującego taką reakcję powstał w latach 60–tych XX wieku. Obecnie czujniki glukozy to ogromny i bardzo dochodowy rynek, największa gałąź całej branży bioczujników.
Rynek ten bardzo się rozwinął
Tak, i wpłynął na to szereg różnych czynników. Na samym początku czujniki czy też same układy analityczne były po prostu stosunkowo dużych rozmiarów. Potem, w latach 70–tych, zaczął rozwijać się przemysł elektroniczny oparty na półprzewodnikach, głównie krzemie, stąd też narodziła się idea wykorzystania miniaturowych struktur półprzewodnikowych jako czujników podstawowych, które można połączyć z elementami biologicznie czynnymi uzyskując w ten sposób pierwsze miniaturowe bioczujniki. Następowała zatem stopniowa miniaturyzacja tych urządzeń. Zaczęto wykorzystywać termistory – elementy mierzące temperaturę bądź zmianę temperatury zachodzącą w czasie reakcji biochemicznych. Z czasem w bioczujnikach pojawiły się również tranzystory polowe, w których usunięto jeden element - bramkę metaliczną. Okazało się, że znajdujący się pod bramką metaliczną izolator np. ditlenek i azotek krzemu są czułe na jony wodorowe – to otworzyło drogę do detekcji elektrochemicznej, a w szczególności detekcji potencjometrycznej z wykorzystaniem jonoczułych tranzystorów polowych (ang. ion-selective field effect transistor, ISFET).
Obecnie intensywnie pracuje się także nad mikromacierzami DNA, których jednakże nie można bezpośrednio zaliczyć do grupy bioczujników. Mikromacierze to również ogromny rynek. Ich wielką zaletą jest możliwość prowadzenia dużej liczby reakcji hybrydyzacji DNA równolegle, w zdefiniowanych polach mikromacierzy.
Jak zatem można zdefiniować bioczujnik?
Konstrukcja bioczujnika jest dwuelementowa. Jedną część stanowi przetwornik elektroniczny, optoelektroniczny lub optyczny. Na jego powierzchni zaimmobilizowany, czyli unieruchomiony jest jakiś biologicznie aktywny czynnik. Czynnik biologiczny mogą stanowić np. enzymy, kwasy nukleinowe, przeciwciała, mogą to być nawet całe komórki lub fragmenty tkanek. Obecnie jednak ze względu na czas życia i skomplikowany proces podtrzymywania aktywności biologicznej dużych, złożonych obiektów, takich jak komórki czy tkanka, jako czynnik biologiczny wykorzystuje się zwykle DNA, przeciwciała lub enzymy. I to jest nasz główny obszar badawczy. Skupiamy się przede wszystkim na przetwornikach elektrochemicznych tzn. takich, w których na powierzchni czujnika zachodzi reakcja redoks lub reakcja wymiany jonowej, np. elektrody jonoselektywne, czy jonoczułe tranzystory polowe – to jest jedna gałąź naszych badań. Czujniki amperometryczne, na powierzchni których zachodzi reakcja utleniania bądź redukcji, w której następuje transfer elektronu do lub z elektrody pracującej. Uwolnienie elektronu może być wynikiem np. reakcji enzymatycznej zachodzącej na elektrodzie lub w bezpośredniej jej bliskości. Zatem, w takich układach następuje pomiar natężenia prądu płynącego między odpowiednio spolaryzowanymi elektrodami.
Czy wszystkie elementy bioczujników, nad którymi pracuje się w pani pracowni wytwarzane są na miejscu?
Współpracujemy z Instytutem Technologii Elektronowej w Warszawie, który dostarcza nam elementy półprzewodnikowe czujników, wcześniej wspomniane przetworniki elektryczne. W naszym laboratorium nie mamy technologii cienkowarstwowych i półprzewodnikowych, zatem nie mamy możliwości ich wytwarzania. Natomiast w naszym laboratorium prowadzone są prace nad modyfikacją tych struktur mającą na celu przyłączenie materiału biologicznie aktywnego do ich powierzchni. Technologia, którą dysponujemy w naszym laboratorium jest oparta na technikach grubowarstwowych umożliwiających wytworzenie np. czujników amperometrycznych. W naszym laboratorium robimy zatem część przetworników, dokonujemy modyfikacji powierzchni i dołączamy materiał biologiczny do części elektronicznej, a następnie dokonujemy wszelkich analiz reakcji zachodzących na powierzchni bioczujników.
Jak to się dzieje, że element biologiczny współpracuje z czujnikiem elektronicznym?
Wynikiem każdej reakcji chemicznej, czy to enzymatycznej czy redoks jest jej produkt. Naszym zadaniem jest skonstruowanie takiego czujnika z unieruchomionym na powierzchni chemoczułej materiałem biologicznym, z pomocą którego będziemożna oznaczyć produkty danej reakcji chemicznej lub biochemicznej– będzie mógł służyć jako detektor produktu tej reakcji. W tym właśnie tkwi sedno badań nad bioczujnikami.
Czyli zakres wiedzy potrzebnej do pracy nad bioczujnikami musi być szeroki.
To prawda. Jest to niewątpliwie praca interdyscyplinarna wymagająca zręcznego połączenia wiedzy z zakresu biochemii, elektroniki, chemii (elektrochemii) i inżynierii materiałowej.
Wróćmy do czujników enzymatycznych…
Cechą charakterystyczną czujników enzymatycznych, jest problem z ich wielokrotnym użyciem, albowiem w czasie pracy bioczujników następuje stopniowe lub czasami gwałtowne obniżanie aktywności enzymu. Niektóre enzymy jako złożone cząsteczki białkowe mają wbudowany kofaktor – koenzym, który można regenerować. Natomiast jest grupa enzymów, które nie posiadają wbudowanych kofaktorów. Są to między innymi enzymy z grupy dehydrogenaz, np. dehydrogenaza alkoholowa, która odpowiada za przekształcanie się aldehydu octowego w etanol lub odwrotnie. Enzymy z tej grupy korzystają z kofaktorów zewnętrznych. Zatem w bioczujnikach wykorzystującyCh dehydrogenazy oprócz samego enzymu powinien być obecny kofaktor, który dodatkowo podczas procesu pomiarowego musi być regenerowany. Celem jednego z naszych projektów było opracowanie bioczujnika z elektrochemiczną regeneracją kofaktora jakim jest dinukleotyd nikotynoamidoadeninowy (NAD). W projekcie tym, w celu obniżenia potencjału utleniania NADH i poprawienia stabilności czujnika, stosowaliśmy mediatory transferu elektronów, różne materiały elektrod, w tym polimery przewodzące, takie jak polipirol i polianilina.
Ile zajmuje przygotowanie odpowiedniego, gotowego do pracy bioczujnika?
Wszystko zależy od bezpośredniej współpracy z użytkownikiem, z odbiorcą. Można to zrobić w miarę szybko, np. w tydzień, ale wcześniej należy mieć przygotowaną bazę badawczą tzn. każdy czujnik przed pomiarem powinien być skalibrowany i wystandaryzowany. Nie możemy dopuścić do sytuacji, w której czujnikj mają różną czułość. Odpowiadamy też za wyniki pomiarów uzyskane z wykorzystaniem naszych czujników.
Prowadzicie też państwo badania między innymi nad immunoczujnikami, skierowanymi na wykrywanie białka C-reaktywnego.
CRP jest białkiem, które wskazuje na istnienie stanów zapalnych w organizmie. Oznaczenia tego białaka są wykorzystywane w diagnostyce choroby niedokrwiennej serca, ale należy pamiętać, że jest to marker niespecyficzny. Pojawia się ono w chorobach serca, ale też w stanach chorób onkologicznych. Jeśli chodzi o diagnostykę choroby niedokrwiennej serca, to CRP może być rozpatrywane, jako czynnik ryzyka, w pewnym stopniu prognozujący wystąpienie tej choroby. Osoby, które mają przewlekle podwyższone CRP, są bardziej narażone na wystąpienie choroby niedokrwiennej serca. Zatem, CRP traktujemy bardziej jako predyktor niż bezpośredni czynnik diagnostyczny.
***
CZYTAJ DALEJ – DLASZA CZĘŚĆ WYWIADU, IMMUNOCZUJNIKI I BIOCZUJNIKI DNA
{page_break}
|
IMMUNOCZUJNIKI Mgr Beata Kazimierczak: Immunoczujniki to bioczujniki, w których receptorem biologicznym, odpowiedzialnym za rozpoznanie oznaczanego analitu są przeciwciała. Oprócz ostatnio pojawiających się aptamerów, tylko przeciwciała zapewniają specyficzność wobec poszukiwanego analitu. Z tego powodu immunoczujniki cieszą się niesłabnącym, szerokim zainteresowaniem - mimo, iż historia testów immunologicznych sięga lat 50. XX wieku. Najczęstszymi metodami detekcji immunokompleksu (specyficznego przeciwciała związanego z badanym analitem) są metody optyczne, elektrochemiczne i piezoelektryczne. Metody optyczne i elektrochemiczne najczęściej wykorzystują znakowanie przeciwciał, dzięki któremu możliwa jest ich późniejsza detekcja. Istnieje wiele odmian i form immunotestów. Oprócz typowych takich jak ELISA, do otrzymywania immunokompleksów używamy również: techniki immunoelektroforetycznej, immunochromatograficznej, immunodyfuzyjnej i immunoprecypitacyjnej – w tym testy aglutynacyjne. Immunoczujniki mają duże zastosowanie, w większości dziedzin zarówno gospodarczych, jak i związanych ze zdrowiem tzn. w diagnostyce, analityce medycznej, w przemyśle spożywczym, w farmacji, również w ochronie środowiska, a także są narzędziem w badaniach naukowych.
Ja bezpośrednio pracuję nad takimi immunoczujnikami, które mogą mieć zastosowanie w diagnostyce i analityce medycznej. Dotyczy to konkretnie białek tzw. markerów sercowych. Jedno z nich jest markerem niespecyficznym – jest to białko C-reaktywne (CRP), tzw. białko fazy ostrej, pojawiające się w stanach zapalnych. Drugie z nich, ludzka sercowa troponina I (hcTnI), to specyficzny marker rozpadu kardiomiocytów, czyli uszkodzenia mięśnia sercowego. Sercowa troponina I jest białkiem strukturalnym mięśnia sercowego.
Na razie immunoczujniki znajdują się w fazie badań laboratoryjnych. Być może w tym roku przejdziemy do testów próbek rzeczywistych. Warto zaznaczyć, że metoda, którą my się posługujemy, to metoda elektrochemiczna. Metody elektrochemiczne nad optycznymi mają tę przewagę, że można je stosować w ośrodkach nieprzejrzystych lub o dużej gęstości optycznej. Czyli w takich matrycach jak: krew, ścieki, czy soki. Dlatego uważam, że w tych immunoczujnikach drzemie olbrzymi potencjał.
To jest test fazy stałej ELISA typu bezpośredniego. Jako podłoża stałego używamy membran nitrocelulozowych. Unieruchamia się na membranie oznaczany analit. Nadmiar analitu odpłukuje się i dodaje białko obojętne (np. albuminę wołową), które blokuje niezwiązane miejsca na membranie. Ponownie odpłukuje się niezwiązane z membraną białka. Następnie dodaje się swoiste przeciwciała wyznakowane enzymem. Przeciwciała tworzą z analitem immunokompleksy (reakcja immunologiczna). Po kolejnym płukaniu membranę umieszcza się w roztworze zawierającym substrat reakcji enzymatycznej. Enzym znakujący przeciwciała przeprowadza reakcję enzymatyczną, a produkt tej reakcji utlenia się na elektrodzie czujnika (reakcja redoks) - powodując tym samym przepływ elektronów. Następnie metodą woltamperometrii cyklicznej dokonuje się pomiarów zmiany natężenia prądu w zależności od zmian stężenia oznaczanego analitu. Stężenie poszukiwanego analitu jest wprost proporcjonalne do otrzymywanej odpowiedzi czujnika.
Schemat działania immunoczujników
Elektrody stosowane w immunoczujnikach |
Czy istnieją jeszcze takie nisze, w których można stworzyć bioczujniki, które byłyby nowym „strzałem w dziesiątkę”?
Prof. Dorota Pijanowska: Jeśli chodzi o substancje do oznaczeń, to wybór jest tak duży, że z pewnością nie zabraknie nam tematów do badań. Natomiast jeśli chodzi o samą metodologię, to ciekawym zagadnieniem, w którym pojawia się wiele nowych trendów są mikroukłady analityczne.
Taką praktyczną rzeczą, która mogłaby się okazać strzałem w dziesiątkę jest badanie w miejscu gdzie znajduje się pacjent, choćby w karetce pogotowia. To jest swego rodzaju nisza gdzie wiele z bioczujników, nad którymi obecnie pracujemy można byłoby zastosować.
Będąc na stażu podoktorskim w Twente University w Holandii pracowałam nad jednym z pierwszych na świecie miniaturowych, zintegrowanych układów opartych na mikrodializie, służącym do oznaczeń glukozy, glutaminianów oraz mleczanów. Obecnie ten kierunek badań nad układami mikrofluidycznymi jest szeroko kontynuowany, również w naszym Instytucie prowadzimy badania wykorzystujące pewne układy mikroprzepływowe. Jednym z nich jest mikroreaktor do hodowli komórkowych – taka alternatywa dla stacjonarnych warunków hodowli a drugi, to chip do elektroforezy kapilarnej.
Czy ma pani jakieś noworoczne marzenie?
Chciałabym, aby zwiększyły się możliwości wykorzystania naszych wyników w praktyce. Dopuszczenie opracowanych bioczujników do zastosowań klinicznych wymaga jednak uzyskania wielu certyfikatów jakości, czy spełnienia różnych standardów, często związanych z wykonaniem szeregu badań i prac rutynowych. Stanowi to barierę, która często okazuje się trudna do pokonania. Natomiast z drugiej strony brakuje mechanizmów i jednostek, które odciążyłyby pracowników naukowych od całościowego prowadzenia tych prac.
Dziękuję za rozmowę i życzę sukcesów!
|
BIOCZUJNIKI DNA Mgr Joanna Jankowska - Śliwińska: Bioczujniki to urządzenia, które jako element receptorowy zawierają cząsteczki biologiczne: enzymy, przeciwciała, a także DNA. Niegdyś taki element receptorowy stanowiły komórki lub fragmenty całych tkanek, jednak warunkiem wykorzystania tego typu cząstek biologicznych jest to aby były one żywe, co jest trudne do uzyskania w warunkach laboratoryjnych. Dlatego też dąży się do zmniejszenia elementu receptorowego do pojedynczych cząsteczek związków biologicznych. W mojej pracy zajmuję się czujnikami DNA, czyli czujnikami, które jako element receptorowy zawierają nici DNA. Wśród czujników DNA można wyróżnić trzy grupy sensorów:
oraz grupa czujników, którymi się zajmuję, czyli
Przedstawiony podział bioczujników DNA przyjęto ze względu na dalsze zastosowanie danej grupy czujników. Ogólnie bioczujniki DNA mają zastosowanie w diagnostyce medycznej – m. in. mogą służyć do wykrywania mutacji genów (do diagnostyki chorób genetycznych), w badaniach prenatalnych. Są stosowane także w kryminalistyce i do wykrywania zanieczyszczeń w pożywieniu.
Bioczujniki, które są przedmiotem moich badań mogą być zastosowane do selektywnej detekcji np. leków, których budowa cząsteczki umożliwia wnikanie pomiędzy sparowane zasady azotowe w podwójnej nici DNA. Zjawisko to zostało nazwane interkalacją, a dotyczy związków, które posiadają płaski skondensowany układ pierścieni aromatycznych lub heteroaromatycznych. Dzięki interkalacji nawet w złożonej, wieloskładnikowej próbce, zawierającej np. białka, możemy selektywnie oznaczyć badany związek. Podstawą detekcji badanych i opracowywanych przeze mnie czujników jest pomiar elektrochemiczny. Na powierzchni elektrod pracujących unieruchomione są podwójne nici DNA o odpowiedniej sekwencji zasad azotowych. Taki bioczujnik zanurzany jest w roztworze badanej próbki, po interkalacji badanego związku wykonywany jest pomiar elektrochemiczny. Odpowiednio dobrana metoda detekcji elektrochemicznej, a także warunki pomiaru pozwalają na uzyskanie wysokiego sygnału analitycznego badanych związków. Warunkiem koniecznym jest oczywiście to, aby badana substancja była elektrochemicznie aktywna, co oznacza, że w pomiarach woltamperometrycznych ulega odwracalnej bądź nieodwracalnej reakcji redoks na danym materiale elektrody pracującej.
Schemat działania bioczujnika DNA. Pierwszy etap przygotowywania czujnika stanowi etap unieruchamiania nici DNA – oligonukleotydu o odpowiedniej sekwencji na powierzchni elektrody. Następny jest etap hybrydyzacji z nicią komplementarną, po czym następuje interkalacja badanego związku do DNA.
|
rozmawiał red. Tomasz Sznerch
pomoc w redagowaniu Dominika Michalak.
KOMENTARZE