Wszystko zaczyna się od wyboru
Naturalnie pierwszym etapem prowadzącym do zaprojektowania procesu modyfikacji genetycznej jest wybór genu, który chcemy poddać klonowaniu oraz organizmu i tkanki, z których gen ten zostanie pozyskany. Wybór genu i organizmu uzależniony jest oczywiście od tego jaki produkt chcemy uzyskać. Następnie, z wykorzystaniem atlasu ekspresji genów (http://www.ebi.ac.uk/gxa/) możliwe jest przeprowadzenie analizy poziomu ekspresji genu w poszczególnych tkankach organizmu. Dla mysiego Ifng otrzymujemy długą listę danych o poziomie ekspresji z informacją, że czerwonym tłem zaznaczono liczbę badań wskazujących na podwyższoną ekspresję, niebieskim – obniżoną, natomiast białym standardowy poziom ekspresji analizowanego genu. Fragment tabeli dla mysiego Ifng przedstawia się następująco:
W celu zagwarantowania teoretycznie stosunkowo wydajnej izolacji DNA należy wybrać tkankę o największej liczbie badań wskazujących na podwyższoną ekspresję genu będącego przedmiotem projektu.
Mam wybrany gen... i co z nim zrobić?
Kolejnym etapem jest odszukanie sekwencji nukleotydowej genu. W tym celu można skorzystać z wirtualnego banku genów (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/) i przechodząc do zakładki „NCBI Reference Sequences (RefSeq)” odszukać sekwencję referencyjnego mRNA (link NM), a w jej obrębie sekwencję dojrzałego białka (kliknięcie w „mat_peptide” powoduje jej zaznaczenie). Dla naszego przykładowego Ifng:
Sekwencję dojrzałego peptydu następnie należy wprowadzić do programu, w którym dokonywać będziemy dalszego „klonowania” in silico. Może to być np. PlasmaDNA, który jest udostępniony do pobrania na stronie Uniwersytetu Helsińskiego (http://research.med.helsinki.fi/plasmadna/). Aby to zrobić po uruchomieniu programu należy wybrać opcję Enter/Paste Sequence (jak zaznaczono zdjęciu poniżej).
Analogicznie należy wprowadzić sekwencję wektora, do którego gen ma zostać wklonowany (w naszym projekcie wektora pUET3).
Przejdź dalej i zobacz jak zintegrować materiał genetyczny z plazmidem!
{page_break}
Czas na cięcie!
Kolejnym krokiem jest dobór enzymów restrykcyjnych, które umożliwią zaplanowanie integracji materiału genetycznego kodującego pożądany produkt z plazmidem pUET3. W tym celu przydatny jest serwis internetowy NEBcutter (http://tools.neb.com/NEBcutter2/). W pojawiającą się na stronie ramkę należy wkleić sekwencję nukleotydową dojrzałego peptydu, poniżej zaznaczyć opcję „Linear”, ponieważ klonowany materiał genetyczny pochodzi z organizmu eukariotycznego, a następnie wybrać „Submit”, jak zaznaczono na zdjęciu poniżej.
Serwis wyświetla enzymy restrykcyjne, których miejsca rozpoznania znajdują się w obrębie sekwencji kodującej gen. Naszym celem jest wprowadzenie kompletnego kodu do plazmidu, w związku z czym poszukujemy enzymu, który nie będzie trawił klonowanej sekwencji, ale będzie przecinał w dowolnym miejscu sekwencję MCS (Multi Cloning Sequence) plazmidu. Wybieramy więc opcję „0 cutters” i wyświetloną listę porównujemy z restryktazami posiadającymi miejsca rozpoznania w obrębie plazmidu. Jednocześnie dobrze jest wybrać dwa różne enzymy restrykcyjne – to zagwarantuje określoną orientację wklonowanego genu w materiale genetycznym wektora.
Przejdź dalej i zobacz jak namnożyć sekwencję wybranego genu!
{page_break}
Gotowi, do startu, START!
Początkowym etapem klonowania jest namnożenie sekwencji wybranego genu, która potem zostanie wprowadzona do wektora. Najlepszym narzędziem do osiągnięcia tego efektu jest reakcja PCR (Polymerase Chain Reaction). Do przeprowadzenia reakcji PCR niezbędne są startery, czyli krótkie, jednoniciowe syntetyczne sekwencje oligonukleotydowe komplementarne do brzegowych sekwencji matrycy, zapoczątkowujące jej amplifikację. Dobór długości starterów opiera się głównie na ich temperaturze topnienia, która powinna mieścić się w zakresie 50-60°C. Jest to bowiem temperatura optymalna dla przyłączania starterów w reakcji PCR. Zbyt niska temperatura stwarza ryzyko niespecyficznego rozpoznawania sekwencji matrycy przez startery, natomiast zbyt wysoka może doprowadzić do niewydajnego przyłączania się do sekwencji komplementarnej. Aby odpowiednio dobrać startery należy zatem przeprowadzić analizę termodynamiczną. Można do tego wykorzystać program VectorNTI (wersja demo dostępna na stronie: (http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Cloning/vector-nti-software/vector-nti-advance-software/vector-nti-advance-downloads.html#zero), wybierając opcje tak, jak zaznaczono na rysunku poniżej.
W pojawiające się wówczas okno należy wkleić sekwencję potencjalnego startera i sprawdzić jego temperaturę topnienia (Tm). Dobór starterów odbywa się na zasadzie prób i błędów oraz indywidualnego wyczucia, ale zakłada się, że ich długość powinna wynosić około 20 nukleotydów. Jednocześnie należy pamiętać, że muszą mieć zbliżoną temperaturę topnienia. To ułatwi bowiem zaplanowanie profilu termicznego reakcji PCR w dalszym etapie.
Wskazane jest również, aby przeanalizować, czy wybrane przez nas startery nie tworzą dimerów i struktur typu „szpilka do włosów”. Można to zrobić w tym samym programie wybierając opcję zaznaczoną czerwoną ramką na rysunku. Ewentualnie powstające struktury drugorzędowe nie powinny mieć wartości energii Gibbsa (dG) niższych niż -10. Zakłada się, że powstawanie struktur wykazujących dG większe od -10 zachodzi z bardzo małą wydajnością i nie zakłóca procesu klonowania. Analogiczną analizę należy wykonać dla obu starterów korzystając z opcji „Analyses‑>Oligo Analyses-> Oligo Duplexes”.
Kolejnym krokiem przy doborze starterów jest wykonanie testu ich specyficzności względem referencyjnych sekwencji genomu i transkryptomu. Można to zrobić korzystając z narzędzia Primer-BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/). Na stronie należy w odpowiednich miejscach wkleić sekwencje starterów i zaznaczyć opcje, takie jak organizm, którego sekwencja ma zostać poddana analizie.
Po kilkudziesięciu sekundach otrzymujemy wynik. Ważne jest, aby serwis nie znalazł potencjalnych produktów o podobnej długości do pożądanego. Ewentualne dłuższe fragmenty materiału genetycznego będą amplifikowane z niewielką wydajnością, a zarówno znacząco krótsze jak i dłuższe produkty można będzie łatwo oddzielić przez elektroforezę na żelu.
Przejdź dalej i zobacz jak poprawnie zamplifikować gen!
{page_break}
Amplifikujemy!
Po odpowiednim doborze starterów należy zaplanować reakcję PCR. W tym celu niezbędna jest, wcześniej analizowana, temperatura topnienia starterów. Najprostszy schemat zakłada następujący przebieg reakcji PCR:
Na przedstawionym schemacie x1 jest temperaturą przyłączania starterów. Zatem jeżeli temperatury topnienia obu starterów są zbliżone przyjmuje się wyższą z nich. Natomiast x2 jest czasem elongacji niezbędnym do uzyskania pożądanego produktu. W dużym przybliżeniu można założyć, że aby uzyskać produkt o długości 1000 par zasad wymagane jest 60-cio sekundowe wydłużenie starterów. Znając długość pożądanego produktu, łatwo można zatem obliczyć czas do zaprojektowania reakcji PCR. Jednocześnie reakcja amplifikacji wykazuje najwyższą wydajność gdy liczba cykli wynosi 20-40.
Po wykonaniu tych czynności możliwa jest symulacja reakcji PCR w programie PlasmaDNA. W tym celu należy wprowadzić do programu sekwencje obu starterów (przez opcję „+” pod seledynową strzałką – pokazano na rysunku), wybrać jako matrycę sekwencję dojrzałego peptydu wraz z „dołączonymi” fragmentami rozpoznawanymi przez wybrane wcześniej restryktazy oraz na końcu 3’ sekwencję TGA, czyli tzw. sekwencję stop. Można również dodać na obu końcach sekwencji „przedłużenia” gtggtg ułatwiające trawienie rozpoznawanych sekwencji.
Następnie należy wybrać opcję „PCR Window” i tam zadać programowi odpowiednio matrycę i primery. Jednocześnie zaznaczając opcję „show” mamy możliwość obserwacji efektów każdej wykonanej czynności.
Uzyskany produkt reakcji PCR oraz wektor należy poddać trawieniu, przez wybranie opcji „Digest” i zaznaczenie ustalonych wcześniej enzymów restrykcyjnych.
Ostatnim krokiem do otrzymania wirtualnego wektora z wklonowanym wybranym genem jest ligacja trawionych restryktazami fragmentów – wektora oraz produktu reakcji PCR. Wykonujemy ją przez wybór opcji „Ligation Window” i wprowadzenie odpowiednich fragmentów. Opcja „Show” pozwala nam obejrzeć efekt naszych działań. W procesie wklonowywania „in silico” genu Ifng do wektora pUET3 powstaje plazmid rekombinantowy przedstawiony na rysunku z zaznaczonym na żółto genem fuzyjnym.
Na koniec możemy jeszcze sprawdzić czy faktycznie nasze działania doprowadziły do uzyskania wektora, którego wprowadzenie do organizmu doprowadzi do produkcji pożądanego produktu białkowego. Aby to zrobić należy sprawdzić zgodność ramki odczytu białka. W tym celu należy wybrać opcję ORF’s (Open Reading Frame) w okienku „Ligation”:
Porównując otrzymane ramki odczytu z sekwencją aminokwasową znajdującą się w wirtualnym banku genów, z którego korzystaliśmy przy poszukiwaniu sekwencji nukleotydowej (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/ - zakładka „NCBI Reference Sequences (RefSeq)”, link NP) możemy sprawdzić prawidłowość przeprowadzonego przez nas klonowania in silico. Czasem niestety dopiero na tym etapie okazuje się, że sekwencja dojrzałego peptydu nie trafia dokładnie w ramkę odczytu. Wówczas należy dodać jeden bądź dwa nukleotydy między fragment rozpoznawany przez restryktazy, a sekwencję dojrzałego peptydu i proces zaplanować ponownie.
Opracowała Edyta Bartusik
KOMENTARZE