Biotechnologia.pl
łączymy wszystkie strony biobiznesu
Wirtualne klonowanie, czyli jak zaprojektować własny transgeniczny organizm
Od pewnego czasu toczą się zażarte dyskusje pomiędzy przeciwnikami i zwolennikami genetycznie modyfikowanych organizmów. Naukowcy specjalizujący się w biologii molekularnej upatrują dużą szansę w wykorzystaniu zarówno roślin jak i zwierząt hodowlanych do produkcji leków, a dopuszczenie przez FDA do obrotu rynkowego ATrynu – pierwszego leku pozyskiwanego z mleka modyfikowanych genetycznie kóz, spowodowało dynamiczny rozwój badań nad wykorzystaniem zwierząt hodowlanych do produkcji środków terapeutycznych. Proces opracowania modyfikacji genetycznej pozwalającej uzyskać wydajną produkcję substancji biologicznie aktywnej np. w liściach roślin czy mleku zwierząt jest procesem bardzo skomplikowanym. Istnieje jednak możliwość stworzenia własnego „projektu molekularnego” z wykorzystaniem ogólnodostępnych programów i serwisów internetowych. Tak więc do dzieła! Spróbujmy zaplanować np. klonowanie mysiego interferonu gamma (Ifng) z wykorzystaniem wektora pUET3.

Amplifikujemy!

Po odpowiednim doborze starterów należy zaplanować reakcję PCR. W tym celu niezbędna jest, wcześniej analizowana, temperatura topnienia starterów. Najprostszy schemat zakłada następujący przebieg reakcji PCR:

 

 

Na przedstawionym schemacie x1 jest temperaturą przyłączania starterów. Zatem jeżeli temperatury topnienia obu starterów są zbliżone przyjmuje się wyższą z nich. Natomiast x2 jest czasem elongacji niezbędnym do uzyskania pożądanego produktu. W dużym przybliżeniu można założyć, że aby uzyskać produkt o długości 1000 par zasad wymagane jest 60-cio sekundowe wydłużenie starterów. Znając długość pożądanego produktu, łatwo można zatem obliczyć czas do zaprojektowania reakcji PCR. Jednocześnie reakcja amplifikacji wykazuje najwyższą wydajność gdy liczba cykli wynosi 20-40.

 

Po wykonaniu tych czynności możliwa jest symulacja reakcji PCR w programie PlasmaDNA. W tym celu należy wprowadzić do programu sekwencje obu starterów (przez opcję „+” pod seledynową strzałką – pokazano na rysunku), wybrać jako matrycę sekwencję dojrzałego peptydu wraz z „dołączonymi” fragmentami rozpoznawanymi przez wybrane wcześniej restryktazy oraz na końcu 3’ sekwencję TGA, czyli tzw. sekwencję stop. Można również dodać na obu końcach sekwencji „przedłużenia” gtggtg ułatwiające trawienie rozpoznawanych sekwencji.

Następnie należy wybrać opcję „PCR Window” i tam zadać programowi odpowiednio matrycę i primery. Jednocześnie zaznaczając opcję „show” mamy możliwość obserwacji efektów każdej wykonanej czynności.

 

Uzyskany produkt reakcji PCR oraz wektor należy poddać trawieniu, przez wybranie opcji „Digest” i zaznaczenie ustalonych wcześniej enzymów restrykcyjnych.

   

 

Ostatnim krokiem do otrzymania wirtualnego wektora z wklonowanym wybranym genem jest ligacja trawionych restryktazami fragmentów – wektora oraz produktu reakcji PCR. Wykonujemy ją przez wybór opcji „Ligation Window” i wprowadzenie odpowiednich fragmentów. Opcja „Show” pozwala nam obejrzeć efekt naszych działań. W procesie wklonowywania „in silico” genu Ifng do wektora pUET3 powstaje plazmid rekombinantowy przedstawiony na rysunku z zaznaczonym na żółto genem fuzyjnym.

 

Na koniec możemy jeszcze sprawdzić czy faktycznie nasze działania doprowadziły do uzyskania wektora, którego wprowadzenie do organizmu doprowadzi do produkcji pożądanego produktu białkowego. Aby to zrobić należy sprawdzić zgodność ramki odczytu białka. W tym celu należy wybrać opcję ORF’s (Open Reading Frame) w okienku „Ligation”:

 

 

Porównując otrzymane ramki odczytu z sekwencją aminokwasową znajdującą się w wirtualnym banku genów, z którego korzystaliśmy przy poszukiwaniu sekwencji nukleotydowej (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/ - zakładka „NCBI Reference Sequences (RefSeq)”, link NP) możemy sprawdzić prawidłowość przeprowadzonego przez nas klonowania in silico. Czasem niestety dopiero na tym etapie okazuje się, że sekwencja dojrzałego peptydu nie trafia dokładnie w ramkę odczytu. Wówczas należy dodać jeden bądź dwa nukleotydy między fragment rozpoznawany przez restryktazy, a sekwencję dojrzałego peptydu i proces zaplanować ponownie. 

 

Opracowała Edyta Bartusik

Źródła

Źródło: materiały własne

KOMENTARZE
news

<Grudzień 2019>

pnwtśrczptsbnd
25
26
27
28
29
30
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
1
2
3
4
5
Newsletter