Red. Tomasz Domagała: Jakie były główne założenia projektu? Jakie problemy projekt miał za zadanie przezwyciężyć?

Dr Ewa Szołajska: Projekt dotyczy opracowania nowatorskiej szczepionki nowej generacji przeciw grypie. Prowadzone badania wpisują się w najnowsze prądy współczesnej wakcynologii, która propaguje szczepionki oparte na cząstkach wirusopodobnych, otrzymywanych w bezpiecznych i wystandaryzowanych warunkach hodowli komórkowych. W opracowywanej szczepionce, jako platformę dostarczającą antygeny, wykorzystujemy cząsteczkę wirusopodobną – dodekahedron adenowirusowy (Dd), o niezwykłych zdolnościach penetracyjnych.

Dd - zdjęcia z mikroskopu elektronowego

Działanie obecnie stosowanych szczepionek przeciw grypie opiera się głównie na indukcji przez białko wirusowe hemaglutyninę przeciwciał neutralizujących penetrację wirusa. Zmienność hemaglutyniny powoduje ograniczoną skuteczność działania ochronnego, z czym łączy się konieczność corocznej zmiany składu szczepionki, dokonywanej na podstawie przewidywań Światowej Organizacji Zdrowia (WHO). Co więcej, ogromna większość szczepionek przeciwgrypowych dostępnych na rynku jest otrzymywana według opisanej w latach czterdziestych ubiegłego wieku drogiej technologii, opierającej się na namnażaniu wirusa w zapłodnionych jajach kurzych. Wiadomo powszechnie, że przy groźbie światowej epidemii grypy, wysiłek produkcyjny wszystkich firm farmaceutycznych nie będzie wystarczający dla dostarczenia odpowiedniej ilości szczepionki (nie mówiąc już o niemożności uzyskania ogromnych ilości zapłodnionych kurzych jaj). Istnieje więc konieczność opracowania zarówno nowej strategii jak i nowej technologii otrzymywania szczepionek przeciw grypie.

Naszym celem jest opracowanie szczepionki indukującej jednocześnie odpowiedź immunologiczną humoralną, to znaczy związaną z produkcją przeciwciał, jak i komórkową, w której główną rolę odgrywają cytotoksyczne limfocyty T, odpowiedzialne za eliminowanie komórek zainfekowanych przez wirusa. W opracowywanej szczepionce wykorzystujemy jako platformę szczepionkową dodekahedron adenowirusowy, który dostarcza do komórek układu immunologicznego antygen hemaglutyninę, odpowiedzialny za produkcję przeciwciał neutralizujących oraz epitopy z białka M1 (wewnętrzne białko wirusa grypy), które jest odpowiedzialne za indukcję odpowiedzi komórkowej podczas zakażenia wirusem. Ponieważ białko M1 jest białkiem stabilnym genetycznie, zakładamy, że opracowywana szczepionka będzie odznaczać się szerokim spektrum działania skierowanym przeciwko różnym szczepom wirusa grypy. Przy zastosowaniu takiej szczepionki, jeżeli indukowane przez szczepienie przeciwciała nie zablokują wniknięcia wirusa do organizmu, działanie limfocytów cytotoksycznych będzie łagodzić przebieg infekcji. Zarówno dodekahedron jak i białka antygenowe otrzymujemy przez nadprodukcję w komórkach owadzich, co eliminuje konieczność pracy z niebezpiecznym wirusem grypy.

Co czyni adenowirusowy dwunastościan (Dd) tak obiecującym systemem dostarczania leków?

Dodekahedron jest cząsteczką wirusopodobną zbudowaną wyłącznie z jednego białka kapsydu adenowirusa, które to białko jest odpowiedzialne za penetrację komórkową adenowirusa. Jest to pentameryczne białko zwane podstawą pentonu (ang. Penton base). Dwanaście białek podstawy pentonu samorzutnie tworzy Dd, cząsteczkę wiruso-podobną (virus-like particle), w trakcie ekspresji w komórkach owadzich. Niezwykłą właściwością Dd w kontekście jego zastosowania jako nośnika jest nadzwyczajna zdolność penetracji do komórek na drodze endocytozy. Do jednej komórki w hodowlimoże wniknąć do 300 000 cząsteczek Dd, które, dzięki poliwalencyjności są w stanie przynieść nawet kilka milionów cząsteczek  terapeutycznych.

Ponieważ Dd nie zawiera materiału genetycznego, jego użycie nie stwarza zagrożenia mutagenezą insercyjną. Stanowi to o przewadze Dd nad wektorami wirusowymi. Dodatkowo, po wniknięciu do komórek dodekahedron ulega całkowitej degradacji na drodze proteolizy. Istotne jest również, że preparaty Dd mogą być przechowywane po mrożeniu czy liofilizacji, cząsteczki zachowują integralność również w temperaturze do 45^oC. Co bardzo ważne, podczas badań w modelu zwierzęcym nie zaobserwowaliśmy żadnych efektów wskazujących na toksyczne działanie naszego nośnika. Zastosowanie Dd jest więc atrakcyjną alternatywą w stosunku do użycia nośników chemicznych czy nanomateriałów, z trudem (albo wcale) ulegających biodegradacji oraz wykazujących znaczną toksyczność i działania uboczne.

Pani zespół skoncentrował się na dwóch konkretnych wykorzystaniach Dd, konkretnie wykorzystaniem go w roli platformy do dostarczania przeciwciał przy produkcji szczepionek przeciwko grypie oraz jako nośnika środków terapeutycznych mających trafić do guzów nowotworowych. Czemu akurat te dwa zastosowania?

Uważamy, że dodekahedron adenowirusa jest idealnym kandydatem do wykorzystania w konstrukcji szczepionek. Dd bardzo wydajnie penetruje do komórek dendrytycznych, które są głównymi komórkami prezentującymi antygeny i odgrywają podstawową rolę w pobudzeniu limfocytów T. Dd o wielkości około 40 nm będzie wychwytywany przez komórki dendrytyczne obecne zarówno w miejscu podania szczepionki jak również zasiedlające węzły chłonne. Dodatkowo, przy zastosowaniu Dd jako platformy szczepionkowej, nawet slaby efekt immunogenny samego Dd nie ma większego znaczenia.

Równolegle, zastosowaliśmy Dd jako nośnik niskocząsteczkowych związków przeciwrakowych. Pozwala to na ukierunkowanie leku do tkanek nowotworowych oraz usprawnienie jego dostarczenia do wnętrza komórek.  Może to być zrealizowane dzięki już wspomnianej niezwykłej wydajności wnikania poliwalencyjnego Dd do komórek oraz w związku z potencjalnym ukierunkowaniem nośnika do ognisk nowotworowych w organizmie. Dd wnikając do komórek ludzkich wykorzystuje jako receptory siarczany heparanu (HS) oraz integryny αv. Receptory te wykazują wysoki poziom ekspresji na powierzchni komórek śródbłonka nowopowstałych naczyń krwionośnych odżywiających guzy (αv), lub komórek nowotworowych (HS, αv).

Użycie Dd może prowadzić do wybiórczego dostarczenia leku do guza również w związku z różnicą w budowie naczyń krwionośnych prawidłowych oraz w obrębie tkanki nowotworowej. Dd z przyłączonym lekiem może swobodnie przenikać przez powiększone szczeliny w obrębie naczyń guza, podczas gdy śródbłonek prawidłowo wykształcony stanowi barierę dla cząsteczek. Dodatkowo, dzięki rozluźnianiu ścisłych połączeń między komórkami Dd jest w stanie przenikać z komórki do komórki sąsiedniej, co znacznie usprawnia dystrubucję niesionego leku.

Jakie wyniki udało się do tej pory otrzymać Pani zespołowi? Czy spełniają one Pani oczekiwania?

Model Dd z epitopami białka M1 (żółte kółka)

Opracowaliśmy dwa rodzaje preparatów szczepionkowych, wykorzystując białko M1 wirusa grypy. W pierwszej próbie przy pomocy łącznika białkowego przyłączyliśmy do Dd białko M1 pełnej długości, podczas gdy w drugim podejściu epitopy immunodominujące pochodzące z białka M1 zostały włączone do struktury nośnika. Oba preparaty świetnie penetrowały ludzkie komórki dendrytyczne i wywoływały specyficzne reakcje komórek T, wskazując, że Dd może być użyty jako poliwalentna platforma dla wywoływania odporności komórkowej. Co bardzo ważne, szczepienie kurczaków preparatem Dd z epitopami M1 indukowało długotrwałą komórkowąodpowiedź immunologiczną, przy całkowitej nieobecności adjuwantów.Już wcześniej pokazaliśmy, że sama cząsteczka wirusopodobna aktywuje komórki układu immunologicznego i wzmacnia prezentację antygenów, eliminując konieczność stosowania potencjalnie szkodliwych adjuwantów. Uzyskane wyniki potwierdziły poprawność założeń projektu.

W naszych badaniach Dd był również wykorzystywany jako nośnik dla stosowanych w chemioterapii leków oraz do dostarczenia potencjalnych czynników przeciwrakowych niezdolnych do penetracji błon biologicznych, przez co nie można było ich dotąd zastosować (ani nawet wykazać ich dzialania p-rakowego). Ten projekt jest realizowany we współpracy z dr hab. Jackiem Jemielitym i dr Joanną Kowalską z Zakładu Biofizyki Instytutu Fizyki Doświadczalnej UW.

Pokazaliśmy na przykładzie dwóch leków bleomycyny i doxorubicyny, stosowanych w systemicznej chemioterapii p-rakowej, że przyłączenie do Dd pozwala na znaczne obniżenie efektywnej dawki leku, zarówno w układzie in vitro, jak i w modelu zwierzęcym raka. Użycie Dd stwarza więc możliwość obniżenia terapeutycznej dawki leku, a tym samym ograniczenia działań ubocznych chemioterapii. Równoległe użycie koniugatów Dd z doxorubicyną oraz z analogiem struktury kap, który jest inhibitorem onkogenu – czynnika inicjacji translacji eIF4E ‑ wywołało zahamowanie o 40% wzrostu guzów w szczurzym modelu raka wątroby. Ponadto obserwowaliśmy równomierne rozmieszczenie dostarczonych przez Dd czynników w obrębie guzów, podczas gdy nie stwierdziliśmy ich obecności w zdrowej tkance wątroby, co potwierdziło nasze przewidywania dotyczące naturalnego ukierunkowania Dd do tkanek nowotworowych.

Należy podkreślić, że badania były prowadzone przez mały zespół pracujący w Instytucie Biochemii i Biofizyki Polskiej Akademii Nauk w ramach stosunkowo niewysokiego budżetu.  Przez cały czas trwania badań współpracujemy z dr hab. Jadwigą Chroboczek, w której laboratorium we Francji po raz pierwszy otrzymano rekombinowane dodekahedrony, oraz z kilkoma zagranicznymi ośrodkami naukowymi na różnych etapach realizacji projektu.

Czy/Kiedy można liczyć na powszechne wykorzystanie wyników uzyskanych przez Pani zespół w medycynie?

Wprowadzenie do użycia nowego produktu leczniczego musi być poprzedzone badaniami dotyczącymi potencjalnej toksyczności przeprowadzonymi na zwierzętach oraz jego skuteczności i braku toksyczności, wykazanej w badaniach klinicznych u ludzi. Wiadomo, że tego typu badania są nie tylko długie (10 do 15 lat), ale również bardzo kosztowne. W tej chwili nasz wysiłek skupia się na zdobyciu funduszy na przeprowadzenie niezbędnych badań przedklinicznych. Jednocześnie poszukujemy partnera przemysłowego zainteresowanego produkcją preparatów opartych na Dd. W działaniach tych wspiera nas Ośrodek Transferu Technologii BioTech-IP (Bio&Technology Innovations Platform) działający na terenie Biocentrum Ochota. Przed nami jeszcze długa droga do osiągnięcia celu.

Czy w przyszłości planuje Pani zająć się innymi badaniami związanymi z podobną tematyką? Co jeszcze pozostaje w tej dziedzine do zrobienia?

Aktualnie prowadzimy badania zmierzające do opracowaniem dwóch szczepionek antynowotworowych. Zatrzymam się tutaj, ponieważ nie są one jeszcze objęte ochroną patentową.

Dziękuję za rozmowę.

Rozmawiał red. Tomasz Domagała
Portal Biotechnologia.pl