Rozwój metod do charakteryzowania lub oczyszczania leków biologicznych takich jak białka rekombinacyjne lub przeciwciała monoklonalne, wymaga regularnego przeglądu danych dla ustalenia kolejnych etapów badań i upewnienia się, czy uzyskane wyniki są dokładne, ekonomicznie uzasadnione i nadają się do praktycznego zastosowania. W rezultacie ograniczonych lub późnych interwencji w ten proces, może dojść do nadmiernych kosztów projektu lub porażki możliwości technicznych. Odwrotnie, podejmując wystarczająco wcześnie odpowiednie czynności dotyczące projektu, można zapewnić pomyślny wynik zarówno pod względem technicznym jak i ekonomicznym.
System BLItz reprezentuje wszystkie zalety analizy białek bez stosowania znaczników. Aparat jest w stanie zidentyfikować aktywne białka w pojedynczej kropli próbki. Technika pomiaru jest oparta na interferometrii biowarstwowej (BLI), która pozwala na wykrycie małych zmian liczby biocząsteczek przyłączonych do biosensora Dip and ReadTM.
Technologia BLI ma dużo większy wpływ na rozwój procesu w porównaniu z tradycyjnymi technikami takimi jak ELISA lub HPLC. Umożliwia zapisywanie danych w czasie rzeczywistym, wskutek czego unika się długich faz oczekiwania, co przedłuża generowanie wyników badań ilościowych. Zmniejsza także potrzebę oznaczania specyficznych odczynników, co redukuje zarówno prawdopodobieństwo popełnienia błędu przez badacza, jak i czasochłonność wykonywanej pracy. Krzywe wiązania mogą być uzyskane z czterech mikrolitrów próbki, co redukuje całkowitą ilość materiału potrzebnego do analizy.
Wysoka czułość systemu sprawia, że możliwa jest identyfikacja docelowych związków chemicznych z szerokiego spektrum stężeń, nawet z surowych próbek, które zazwyczaj zawierają złożone spektrum aktywnych biologicznie cząsteczek. Biosensory BLI są więc dostępne w różnych rodzajach, które wykazują bardzo wysoką specyficzność dla docelowych cząsteczek. Ponadto, dostępne są sensory, które mogą być modyfikowane przez użytkowników w celu dostosowania ich do indywidualnych potrzeb.
| Biosensor | Description | Used for | Dynamic Range (Quantitation) |
| Quantitation Assays | |||
| AHQ | Anti-Human IgG Fc | Human IgGs or human Fc-fusion proteins | 0.25 - 1,000 µg/mL |
| AMQ | Anti-Mouse IgG Fv | Mouse IgGs or mouse F(ab')2 | 0.5 - 1,000 µg/mL |
| HIS2 | Anti-HIS | HIS-tagged proteins in crude matrices, buffer or column eluent | typically 0,1 - 500 µg/mL |
| ProA | Protein A | IgGs of various species, including human | 0.5 - 1,000 µg/mL |
| ProG | Protein G | IgGs of various species, including human | 0.5 - 1,000 µg/mL |
| ProL | Protein L | IgGs of various species via the kappa light chain | 0.5 - 1,000 µg/mL |
| Kinetic Assays | |||
| AHC | Anti-Human Fc-Capture | Human IgGs or human Fc-fusion proteins | N/A |
| AMC | Anti-Mouse Fc-Capture | Mouse IgGs or mouse Fc-fusion proteins | N/A |
| SA | Streptavidin | Biotinylated proteins | N/A |
| Quantitation and Kinetic Assays | |||
| FAB | Anti-Human Fab-CH1 | Human IgG, Fab and F(ab')2 | Protein dependent, typically 0.5 - 1,000 µg/mL |
| FLG | Anti-FLAG | FLAG-tagged proteins | Protein dependent, typically 0.5 - 1,000 µg/mL |
| GST | Anti-GST | GST-tagged proteins | Protein dependent, typically 0.5 - 1,000 µg/mL |
| NTA | Ni-NTA | HIS-tagged proteins in buffer or diluted matrix | Protein dependent, typically 0.5 - 1,000 µg/mL |
Oznaczanie ilościowe
Dobór próby z linii komórkowej, jak na przykład ten wykonywany przy produkcji przeciwciał z linii komórek hybrydowych, jest znacznie mniej czasochłonny w przypadku systemu BLItz niż przy zastosowaniu porównywalnych metod. Inkubacja i etapy mycia nie są konieczne, więc miano białka może być precyzyjnie oznaczone w kilka minut. Użytkownicy mogą podjąć przemyślaną decyzję o tym, które kultury powinny być zebrane w jakim czasie, maksymalizując przez to produkcję przeciwciał. Oczekiwanie na koniec procesu zbioru komórek, aby sprawdzić wyniki, nie jest już wymagane.
Oznaczanie ilościowe wymaga zapisu krzywych standardowych dla rozpoznanych stężeń cząsteczek docelowych. W tej próbce, mysie-IgG1 i szczurze-IgG1 były użyte w celu otrzymania serii rozcieńczeń o ustalonej ilości w pożywce kultury hybrydoma-Modyfikowana Pożywka Dulbecco Iscove’a (IMDM)-i mierzona przez 30 sekund biosensorem białka G, uprzednio nawadniana przez 10 minut.
Analiza pożywki kultury komórkowej bez udziału antyciał udoskonaliła wyniki przez natychmiastowe uwzględnienie wartości odniesienia do sygnału tła. Następnie próbki z supernatantu kultury komórkowej o pojemności czterech mikrolitrów były analizowane poprzez dokonanie pomiaru przez 30 sekund w podobny sposób za pomocą nowego biosensora z białkiem G.
System BLItz wykazuje wysoką czułość, która obejmuje szeroki zakres dynamiczny. Stężenie związku docelowego może być określone w zależności od biosensora zastosowanego bez wcześniejszego rozcieńczania w skali od 0,5 do 1.000 ug/ml. Zasadniczo, oznaczanie ilościowe może być przeprowadzone bezpośrednio i szybko, nawet w przypadku złożonych składników pożywki.
Kinetyka powinowactwa i mapowanie epitopów
Co więcej, technologia BLI jest w stanie wykryć interakcje białko-białko. Odpowiednie ustawienie testu powoduje, że określenie parametrów kinetyki takich jak stałe asocjacji i dysocjacji jest możliwe. Otrzymana informacja może mieć nadzwyczaj szeroką gamę zastosowań. Wykorzystując powinowactwo wiązań, zrozumienie właściwości wiążących białek może być osiągalne i modyfikację struktury białka można uznać za wynik otrzymanych danych..
Tak zwana selekcja bezwskaźnikowa identyfikuje cząsteczki z bardzo niską stałą dysocjacji i dla poszczególnych powinowactw wiązań wpływ czynników zewnętrznych na oddziaływanie na siebie białek może być zbadany. Prostota systemu pozwala na szybkie zastosowanie takich technik bez czasochłonnej metody rozwoju lub przekwalifikowania badaczy.
Streszczenie
System BLItz firmy Pall ForteBio do analizy białek bez konieczności stosowania znaczników oferuje szybką i bezpieczną metodę ilościowego oznaczania białek. Umożliwia podejmowanie wczesnych i przemyślanych decyzji w stosunku do dalszego planu procesu i może uzupełnić lub nawet zastąpić czasochłonne metody. Podczas gdy tradycyjne procedury wymagają dużych nakładów pracy i wykorzystania zasobów, system BLItz rozpoznaje stężenia w skali ng/ml w kilka sekund.
Dodatkowo, system ten może być wykorzystany do analizy warunków procesu, rozwoju prób i optymalizacji powiązanych par (mapowanie epitopów). Można go zastosować do oznaczania parametrów kinetyki takich jak powinowactwo wiązania i stałe powinowactwa. W rezultacie, nawet małe laboratoria z ograniczonymi zasobami mogą mieć dostęp do korzyści płynących z tej technologii. Ponadto, praktyczny sposób użycia „nałóż kroplę, odczytaj, gotowe”, ma niską cenę i jest bardzo przyjazny dla użytkownika.
Rysunki
Rysunek główny: System BLItz firmy Pall ForteBio do analizy białek Label-Free w czasie rzeczywistym. Określone biosensory umożliwiają szybki pomiar z zaledwie jednej kropli próbki.
Rys.1: Standardowa krzywa dla mysich izotopów IgGl (a) i szczurzych izotopów IgG1 (b) z pożywki hodowli komórek hybrydoma przy użyciu biosensorów białka G.
Rys. 2: Oznaczanie ilościowe mysiego IgG (a) i szczurzego IgG (b) z supernatantu hodowli komórkowej. Otrzymane dane są przedstawione po lewej. Stężenie (odpowiednio po prawej) jest obliczone przy wykorzystaniu odpowiedniej krzywej standardowej (zob. rys. 1).
Tab. 1: Biosensory Dip and Read dla systemu BLItz firmy Pall ForteBio. Biosensor streptawidynowy (SA) I biosensor AR2G mogą być modyfikowane za pomocą specyficznych ligandów. Q, oznaczanie ilościowe; K, próby kinetyczne
Autorzy
Dr Tim Heiseler, Specjalista w Dziedzinie Stosowania, BLItz
Dr Dirk Sievers, Manager ds Marketingu Technicznego
Pall Poland Sp. z o.o.
ul. Jagiellońska 74
03-301 Warsaw
Phone: +48 (0) 22-510-21-00
Email: pall_poland@europe.pall.com
KOMENTARZE