Biotechnologia.pl
łączymy wszystkie strony biobiznesu
Sekwencjonowanie RNA bezpośrednio w komórce!
Sekwencjonowanie RNA bezpośrednio w komórce!
Zamiast izolować obecne w komórce RNA i badać je z wykorzystaniem metod sekwencjonowania nowej generacji lub mikromacierzy, naukowcy postanowili potraktować całe komórki jako chipy do sekwencjonowania i określić sekwencję cząsteczek mRNA bezpośrednio w ich naturalnym środowisku. Dzięki temu uzyskali informację nie tylko na temat tego jakie geny są aktywne, ale również w jakim miejscu są one ekspresjonowane.

Transkryptomika jest dziedziną pozwalającą określić aktywność poszczególnych genów poprzez badanie transkryptomu (cząsteczek mRNA). Taka analiza może zostać przeprowadzona po wyizolowaniu całości RNA z komórki, a następnie oznaczeniu wyizolowanych sekwencji wykorzystując metody sekwencjonowania nowej generacji (RNA-seq) lub technologię mikromacierzy. Uzyskuje się wówczas informację na temat wszystkich sekwencji (genów), które są w danym czasie aktywne. Nie wiadomo jednak, w jakim miejscu są one ekspresjonowane.

 

Aby poznać lokalizację określonych transkryptów w komórce, należy zastosować inną metodę. Może być nią fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH), w której wprowadza się do komórki sondy – czyli krótkie odcinki DNA znakowane fluorescencyjnie. Jeżeli taka sonda odnajdzie w komórce sekwencję komplementarną, wiąże się do niej, a wynik tej hybrydyzacji obserwujemy pod mikroskopem fluorescencyjnym. Metoda ta jednak nie może zostać użyta do badania aktywności wielu różnych genów w tym samym czasie.

 

Czy można stworzyć technologię, dzięki której możliwe będzie uzyskanie informacji zarówno na temat aktywnych sekwencji jak i ich lokalizacji, za pomocą tylko jednego eksperymentu? Naukowcy z Bostonu i Seattle poczynili pierwsze kroki w tym kierunku. Zaprojektowali metodę, którą nazwali FISSEQ – ang. fluorescence in situ RNA sequencing. Potraktowali całą komórkę jako chip i przeprowadzili reakcję sekwencjonowania bezpośrednio w komórce.

 

Autorzy metody rozpoczęli od przytwierdzenia (immobilizacji) komórek do płaskiej powierzchni. Następnie wprowadzili do nich odpowiednie enzymy, które najpierw przepisały fragmenty RNA na repliki DNA (cDNA), a następnie powieliły te repliki wiele razy, aby stworzyć wiele kopii tego samego DNA na jednym łańcuchu. Osiągnęli to za pomocą tak zwanej amplifikacji według mechanizmu toczącego się koła (ang. rolling-circle amplification). Wygenerowane w ten sposób amplikony stworzyły nanokulki DNA przytwierdzone do miejsca, gdzie pierwotnie znajdował się sekwencjonowany transkrypt. Następnie, bezpośrednio w komórce, zostały one zsekwencjonowane z wykorzystaniem jednej z metod nowej generacji – SOLiD (ang. sequencing by oligonucleotide ligation and detection). Wizualizacja, a co za tym idzie, poprawny odczyt sekwencji, możliwy był tylko dzięki temu, że każda sekwencja występowała na określonym łańcuchu DNA w bardzo wielu kopiach.

 

„To czego dokonał zespół badawczy Georga Churcha to było naprawdę wielkie wyzwanie i duży krok naprzód. Poprzez stworzenie metody, która pozwala wykrywać subtelne, ale bardzo znaczące zmiany w ekspresji genów, a dodatkowo precyzyjnie określać ich pozycję wewnątrz komórki, naukowcy prawdopodobnie zapoczątkowali nową erę diagnostyki molekularnej” – podsumował doktor Don Ingber, dyrektor Wyss Institute. Z kolei sam lider projektu, profesor George Church, widzi następujące zastosowania dla swojej nowej technologii: „Patrząc całościowo na ekspresję genów w komórkach możemy scharakteryzować wiele istotnych procesów m.in. w tak skomplikowanej tkance jaką jest tkanka nerwowa w mózgu. Zobrazowanie wielu z zachodzących w niej procesów było do chwili obecnej niemożliwe. Widzimy naszą nową metodą jako jedną z technologii, która przyczyni się do rozwoju projektu jakim jest zapoczątkowany w 2013 roku BRAIN Initiative. Stosując nową metodę będziemy mogli zrozumieć jak rozwijają się i funkcjonują tkanki zdrowe w porównaniu do tych dotkniętych chorobą.”

Porównanie metod wykorzystywanych do analizy ekspresji genów ze względu na takie parametry jak wydajność i możliwość uzyskania informacji o lokalizacji genu.

Źródła
  1. Highly Multiplexed Subcllular RNA Sequencing in Situ, Science 2014
  2. RNA sequencing in situ, Nature Biotechnology 2014
  3. Wyss Institute at Harvard, http://wyss.harvard.edu/
KOMENTARZE
Newsletter