Cytometria przepływowa od dawna jest istotnym narzędziem w badaniach podstawowych i klinicznych. Znajduje zastosowanie w tak różnorodnych dziedzinach, jak biologia molekularna, neurobiologia oraz biologia roślin i morza. Ostatnio zainteresowanie tą technika wzrosło zwłaszcza w immunoonkologii, ze względu na rolę, jaką może odegrać w poszerzeniu naszego rozumienia układu odpornościowego i jego odpowiedzi na immunoterapię przeciwnowotworową. Ponieważ możliwości i precyzja platform analitycznych stale się poprawiają, również ich korzystny wpływ widać wśród naukowców zajmujących się badaniami immunologicznymi i nad biologią nowotworów. Wydaje się zatem, że przed tą techniką dostępną od dziesięcioleci rysują się szerokie perspektywy.

Tworzenie technologii poprzez pracę zespołową

Większość postępów w cytometrii przepływowej zależała od współpracy naukowców, instytutów badawczych i firm. W 1953 r. amerykański inżynier elektryk Wallace Coulter otrzymał patent na zasadę Coultera, technikę analizy cząstek w płynie. W latach 70. połączone prace immunologa ze Stanford, Lena Herzenberga i firmy Becton, Dickinson and Company (BD) przekształciły cytometrię przepływową w platformę komercyjną – FACS-1 (Sortowanie Komórek Aktywowanych Fluorescencyjnie). Pod koniec lat 70. do cytometrii przepływowej dodano możliwości badań wieloparametrowych. Umożliwili to naukowcy z Los Alamos National Laboratories.

Połączenie tej technologii ze zdolnością do wytwarzania przeciwciał monoklonalnych znakowanych fluorescencyjnie stworzyło to, co Robert Balderas, wiceprezes BD Biosciences nazywa „jednym z najbardziej niesamowitych przykładów współtworzenia w każdej branży”. Wykorzystując przeciwciała monoklonalne do badania komórek rakowych, naukowcy dokopali się do przyczyn choroby i sposobów jej leczenia, zaczynając od platform do cytometrii przepływowej opartych na jednym laserze i zdolności do śledzenia dwóch kolorów. Wraz z rozwojem technologii zwiększyły się możliwości badań nad rakiem: – Teraz budujemy 10-laserowe instrumenty i jesteśmy w stanie rejestrować nawet 30 kolorów na platformach badawczych, takich jak BD FACSymphony z niespotykanym dostępem do 50 różnych parametrów w jednej komórce – wyjaśnia Balderas.

Ryc. 1 Przykładowy rozdział wyników uzyskanych na BD FACSymphony A5 – Populacja Limfocytów

(Panel górny: Limfocyty bramkowano na podstawie CD45 i rozproszenia bocznego, a singlety bramkowano na podstawie szerokości rozproszenia bocznego. Zidentyfikowano komórki TCD3-pozytywne).

(Panel środkowy: Identyfikacja i analiza komórek T CD4/CD8 pozytywnych. Komórki CD8+ są następnie dzielone na naiwne/pamięciowe przez barwienie CCR7/CD45RA. W komórkach T CD8 można również zidentyfikować podzbiór CD38+, a niektóre z tych komórek wykazują ekspresje HLA-DR lub CD32).

(Panel dolny: Analiza komórek T CD4-pozytywnych. Regulatorowe komórki T można zidentyfikować poprzez wybarwienie CD127 i CD25. Również w CD4 wyróżniamy subpopulacje komórek naiwnych/pamięci przez barwienie CCR7/CD45RA. Ostatnie dwa wykresy pokazują ekspresję czterech receptorów chemokin CXCR3, CCR10, CCR4 i CCR6 na komórkach T CD4. Za pomocą tych parametrów można zidentyfikować różne subpopulacje komórek pomocniczych T).

WYŁĄCZNIE DO UŻYTKU BADAWCZEGO. NIE DO UŻYCIA W PROCEDURACH DIAGNOSTYCZNYCH LUB TERAPEUTYCZNYCH. PRODUKT LASEROWY KLASY 1.

Wykorzystanie technologii do walki z rakiem

W miarę jak cytometry przepływowe stają się coraz bardziej wyrafinowane, a biolodzy lepiej rozumieją markery nowotworowe, komórki można podzielić na coraz bardziej specyficzne grupy, które wymagają coraz większej liczby parametrów do ich różnicowania. – Zdolność do rozszyfrowania złożoności komórek rakowych, komórek zrębu i limfocytów naciekających guzy dostarcza nam informacji na temat nowotworów tkanek litych. Ostatnie 25-30 lat to intensywna współpraca onkologów i specjalistów od cytometrii przepływowej. Dzisiaj przechodzimy do badania minimalnej choroby resztkowej (MRD) i możemy wśród różnych populacji komórek znaleźć tę rzadką – mówi Balderas.

W 2006 r. Europejska Fundacja Naukowa ds. Hematoonkologii uruchomiła konsorcjum EuroFlow. – Ta ważna inicjatywa doprowadza do konsensusu w sprawie markerów fenotypowych, które należy przetestować pod kątem wszystkich nowotworów przenoszonych przez krew, ale konsensus jest trudny i wymaga czasu – podkreśla Balderas. Eksperci EuroFlow koncentrują się na opracowaniu szybkich, dokładnych i bardzo czułych metod testowania próbek za pomocą cytometrii przepływowej.

W Perelman School of Medicine na Uniwersytecie Pensylwanii immunolog, Erica Carpenter i jej koledzy wykorzystali cytometrię przepływową w poszukiwaniu krążących komórek nowotworowych (CTC) [I]. Nowotwory zrzucają te komórki, ale niewiele z nich trafia do krwiobiegu, co czyni je niezwykle trudnymi do znalezienia. Jednak CTC można wykorzystać do detekcji nowotworów nawet w początkowej fazie, co prowadzi do wczesnego leczenia.

Zespół Carpenter wyizolował CTC za pomocą cytometrii przepływowej, a następnie przeanalizował mRNA transkrybowany przez komórki. Dzięki temu systemowi naukowcy mogli znaleźć jedną CTC w milionie białych krwinek. Następnie komórki podzielono na podstawie ekspresji genów. Carpenter i jej koledzy stwierdzili: – Takie podejście jest istotne w dobie immunoterapii, takich jak terapia komórkami CAR-T (chimeric antigen receptor T-cell). CTC mogą zostać pobrane od pacjenta i wykorzystane jako cele do opracowania spersonalizowanej terapii przeciwnowotworowej.

Ciągły postęp w cytometrii przepływowej oraz wysiłki EuroFlow i zespołów takich jak zespół Carpenter ujawnią jeszcze więcej szczegółów molekularnych chorób, a także potencjalnych sposobów ich leczenia. Jak mówi Balderas: – Na końcu tego całego procesu jest pacjent i jego dobro.

Grupa analizatorów FACSymphony to:

BD FACSymphony A3 oferuje możliwość badania do 30 parametrów przy użyciu 5 laserów. Dodatkowa zastosowanie nowych barwników BD Horizon Brilliant^TM daje możliwość szerszego fenotypowania. 

Ryc. 2 BD FACSymphony A3

Cytometr przepływowy BD FACSymphony A5 to jedyne w swoim rodzaju urządzenie umożliwiające badanie do 50 parametrów w komórkach. Może być wyposażony aż w 9 różnych laserów. Ten zaawansowany instrument wyposażony jest w ultra niskoszumowy układ elektroniczny VPX, który obsługuje do 50 wysoce wydajnych fotopowielaczy (PMT) i poprawia czułość detekcji, umożliwiając identyfikację i analizowanie rzadkich typów komórek oraz zdarzeń. System ten daje nieograniczone na tę chwilę możliwości szerokiego fenotypowania i analizę zjawisk rzadkich. 

Ryc. 3 BD FACSymphony A5