W rozmowie z naszym portalem prof. Rafał Płoski opowiada dlaczego sekwencjonowanie drugiej generacji to metoda rewolucyjna, jak istotna jest identyfikacja nie dziedziczonych defektów genetycznych, dlaczego samobójstwo jest interesujące z medycznego punktu widzenia, oraz dlaczego NFZ w snach pana Profesora nie występuje…

Biotechnologia.pl: Działa pan w różnych obszarach badawczych i koordynuje pan wiele projektów badawczych. Które w tej chwili zajmują panu najwięcej czasu?

prof. Rafał Płoski: Zdecydowanie wdrażanie analiz sekwencjonowania całogenomowego, w szczególności sekwencjonowania egzomowego. Chcemy dokładnie zidentyfikować wadliwe fragmenty DNA u pacjentów z chorobami wywoływanymi przez defekty genetyczne. To taka diagnostyka, ale bardzo zaawansowana, bo obejmuje analizę i badania całoegzomowe lub całogenomowe.

Jest to analiza wysokoprzepustowa prowadzona na aparacie Illumina HISeq 1500 – co to oznacza?

Dotychczas, przez wiele lat defekty genetyczne były analizowane na podstawie obrazu klinicznego. Lekarz stawiał hipotezę jaki gen może być uszkodzony a następnie ten gen był skrupulatnie sekwencjonowany, kawałek po kawałku. To zajmowało nawet po kilka tygodni na jeden gen. Nigdy nie było 100% pewności co do trafności hipotezy. Defekt mógł być znaleziony, albo nie. Jeśli postawiona teza się nie potwierdziła, badania i cały proces trzeba było powtarzać  z kolejnym genem. Takie badania trwały dosłownie latami i bardzo często prowadziły donikąd. Kilka lat temu dokonała się rewolucja. Powstały urządzenia i technologie, które pozwalają na badanie wszystkich genów całego genomu. W czasie bardzo akceptowalnym, rzędu tygodnia, dwóch, a w szczególnych przypadkach nawet klika dni. Zamiast sekwencjonować pojedynczy gen, wyłoniony na podstawie długiej procedury diagnostycznej możemy sekwencjonować wszystko na raz i potem tylko sprawdzać co jest uszkodzone i na tej podstawie postawiać diagnozę.

Wspomniał pan o analizie egzomowej

Egzom to jest całość wszystkich egzonów czyli fragmentów naszego genomu, które bezpośrednio kodują białko. Egzony są centralną częścią genomu, ponieważ one odpowiadają za strukturę wszystkich białek, które u nas działają, oczywiście poza nimi występują elementy regulatorowe, strukturalne, które też mogą być uszkodzone i prowadzić do choroby, ale egzony są nieporównanie ważniejsze. Co ciekawe one nie są wcale takie duże. Obejmują mniej niż 5% genomu.  A tak naprawdę ich analiza jest sensowna w około 80% chorób genetycznych, stąd rewolucja, o której możemy mówić.

Poszukuje pan defektów genetycznych, które nie są dziedziczone.

Również. Ta metoda pozwoliła wniknąć w coś, co kiedyś było niesłychanie skomplikowane. Mianowicie chodzi o mutacje, które są chorobotwórcze ale nie są dziedziczone. Powstają po raz pierwszy w komórce jajowej czy plemniku, z którego pacjent pochodzi. Natomiast nie są obecne u jego rodziców. To zjawisko niegdyś uważane było za bardzo rzadkie. Ostatnie badania wskazują jednak, że może być częstsze niż się dotąd wydawało.

Pacjent ma pewną zmianę, jeżeli jest ona genetycznie uwarunkowana teoretycznie powinna zostać przekazana potomstwu , bo tak odbywa się dziedziczenie. Problem pojawia się wówczas gdy choroba jest na tyle ciężka, że uniemożliwia prokreację.  Wówczas nie sposób zaobserwować  segregację choroby w rodzinie jak to ma miejsce w przypadku klasycznych wad genetycznych. Choroba jest uwarunkowana genetycznie, bardzo ciężka, ale rodzice pacjenta mutacji nie mają.

W przypadku prowadzonych przez pana badań o jakich chorobach mowa?

To jest faza początkowa badań. Jestem zdziwiony, że na kilkadziesiąt testów, które zrobiliśmy już mamy w trzech przypadkach sytuację, w której właśnie wykryliśmy nową, niedziedziczoną mutację, nie obecną u rodziców. To są różne choroby. W jednym przypadku była to dystrofia mięśniowa. W drugim ciężka choroba skóry. W trzecim przypadku rzadki zespół różnych skomplikowanych wad.

Czy genom pacjenta bada się pod kątem zmian de novo?

Poza genomem pacjenta, żeby wychwycić zmiany de novo trzeba zbadać też rodziców. Zmiany de novo z definicji nie mają rodzice pacjenta. Dlatego taka zmiana w genie w jakiś sposób powiązanym z patogenezą choroby jest bardzo intrygująca. Oczywiście nie wszystkie mutacje de novo są patogenne ale ponieważ takich mutacji u pacjenta stwierdzamy bardzo niewiele to znalezienie takiej mutacji w genie, który akurat łączy się z chorobą jest bardzo silnym argumentem, że ta mutacja wywołuje chorobę.

Jakie jest praktyczne wykorzystanie odnalezionych mutacji?

My stawiamy diagnozę, stwierdzamy obecność mutacji, która ma z chorobą coś wspólnego i to czasem otwiera oczy klinicystom, którzy kilkanaście lat badali pacjenta, starali się go zdiagnozować i to się nie udawało. Jednym z ciekawych przypadków z jakimi mieliśmy do czynienia był pacjent, który miał przeszczepione serce. Jego brat również. Rodzina przez ponad dziesięć lat znajdowała się pod opieką lekarzy, którzy nie wiedzieli na co ci ludzie chorują. Nie byli w stanie przewidzieć kto jeszcze w rodzinie zachoruje i oczywiście nie było mowy o jakimkolwiek rozważaniu leczenia innego niż przeszczep serca. Po naszych badaniach diagnoza postawiona została niemalże natychmiast. Zwracam uwagę na 10 lat badań diagnostycznych, setki godzin różnych specjalistów, różnych badań. Tutaj wystarczył nam tydzień pracy w laboratorium. Próbka też nie sama, tylko z kilkunastoma innymi. Trzy dni analizy informatycznej. Dziesięć minut analizy, w której uczestniczył człowiek i wyszło czarno na białym, że pacjent cierpi na dystrofię Beckera. Znaną chorobę, jednak u niego przebiegającą w sposób nietypowy (choć jednak zgodny z innymi przypadkami w obecności podobnych mutacji). Błyskawiczna diagnoza, trafiona w dziesiątkę. Oczywiście pacjentowi serca to nie przywróci, ale da możliwość poradnictwa genetycznego w całej rodzinie. Pacjent był podejrzewany o metaboliczną chorobę mitochondrialną czyli chorobą z zupełnie innej grupy. W tym przypadku okazało się, że w jakimś sensie najciemniej jest pod latarnią, co jednak nie umniejsza znaczenia wyniku dla pacjenta i prowadzących lekarzy.

Czyli w zasadzie te badania wpisują się w ideę medycyny spersonalizowanej.

Nie wspomnieliśmy o tym, ale oddzielny nurt współczesnej genetyki to sekwencjonowanie genomów guzów nowotworowych. Tu też jest pewna analogia z poszukiwaniem mutacji de novo - szukamy tych zmian, które różnią nowotwór od tkanki zdrowej, czyli sekwencjonujemy cały nowotwór czy egzom i zdrową tkankę, a następnie patrzymy czym się różni nowotwór. Wśród tych różnic występują oczywiście mutacje, które są niezwykle ważne dla zrozumienia mechanizmu powstania i rozwoju tego nowotworu. Coraz częściej rozpoznawane są też mutacje, które pozwalają stosować określone leki działające na zmutowane białka. To jest właśnie rdzeń medycyny spersonalizowanej w kontekście sekwencjonowania.

Naszym problemem jest to, że w pobliżu nie ma żadnego dużego ośrodka onkologicznego. Warszawski Uniwersytet Medyczny nie ma kliniki onkologii, która byłaby kliniką WUM-u. W Warszawie jest Instytut Onkologii, ale to duża placówka, która ma swój zakład i niekoniecznie z nami musi współpracować. My mamy potencjał i moglibyśmy te badania robić gdybyśmy mieli materiał kliniczny, z którym jest szansa znalezienia czegoś co przełoży się na konkretny efekt terapeutyczny. Tu już mówimy, nie o diagnozie, nie o jakimś informowaniu pacjenta co mu jest, jak to ma miejsce w chorobach dziedzicznych. Tu mówimy konkretnie o wiedzy, która w jakimś procencie przypadków pozwala bardzo dobrze leczyć i to czasami w sposób spektakularny. Czasami jesteśmy w stanie dobrać lek, który na pewno nie został by dobrany do pacjenta, bo powiedzmy tylko 5% guzów odpowiada na ten lek. Dawanie go wszystkim jest stratą pieniędzy i też w pewnym sensie zdrowia pacjentów, dla których leki onkologiczne nie są obojętne. My jesteśmy po to, aby wyłapać te 5% pacjentów, którzy odniosą największą korzyść. W niektórych krajach traktuje się to nie jako badanie naukowe, tylko badanie rutynowe. Przed nami jest jeszcze długa droga. Byłbym bardzo ciekaw jakie byłyby wyniki analizy, która dałaby odpowiedź na pytanie czy ta rutynowa metoda diagnostyczna, która kosztuje ok. 5 tysięcy zł za pacjenta nie jest lepszym rozwiązaniem od inwestowania w leczenie onkologiczne, które jest dużo, dużo droższe, a które często nie przynosi żadnego efektu. Jak to oszacować? Trudno powiedzieć, ale jestem pewny, że wyniki udowodniłyby, że diagnostyka genetyczna jest ekonomicznie uzasadniona.

Czy te badania mogą na przykład być podstawą do stworzenia nowych testów diagnostycznych?

Jak najbardziej nasze badania mogą mieć charakter aplikacyjny. Szczególnie mówimy o chorobach, które dotychczas są słabo poznane jeśli chodzi o gen, które je wywołuje, czy o nowotworach z nierozpoznanymi mutacjami. Prowadząc badania genomowe czy egzomowe i identyfikując odpowiednie mutacje może doprowadzić do opracowania prostych, klasycznych testów diagnostycznych opartych na jednym czy kilku genach.

Prowadzi pan również badania ukierunkowane na identyfikację genów, które bezpośrednio nie wywołują chorób, lecz w pewnych przypadkach podnoszą ryzyko zachorowania.

To są badania, które określa się jako asocjacyjne. Część zmian w genach powoduje wyraźne, ewidentne choroby genetyczne. To są choroby najczęściej dziedziczne, chyba że mamy tam nowe mutacje. Choroby dosyć ciężkie, rzadkie i choroby synonimiczne z defektem genetycznym. Kto ma defekt jest chory, kto nie ma jest zdrowy. Poza tymi tzw. chorobami jednogenowymi pozostała grupa to choroby, w których geny odgrywają poboczną rolę, tzw. choroby wieloczynnikowe. W tych chorobach nie mamy synonimicznego układu - zmiana genetyczna i choroba, natomiast sytuacja jest taka, że tło genetyczne zwiększa ryzyko choroby. Mamy np. 5, 10, 30 genów, z których każdy troszeczkę zwiększa ryzyko choroby. Niektóre z tych genów zwiększają ryzyko jednej choroby, ale zmniejszają ryzyko innej. Po prostu, każdy z nas ma zestaw genów, który czyni go bardziej lub mniej podatnym na różne schorzenia, a odpornym na jeszcze coś innego. Te powiązania są słabe, a ich badania to są badania asocjacyjne. Badamy czy dany gen jest powiązany z daną chorobą, jednak nie można powiedzieć, że ją powoduje. Te badania są ciekawe z punktu widzenia samego zaangażowania genów w chorobę. Choroby, które badamy pod tym kątem to są naprawdę najczęstsze choroby, stanowiące problem cywilizacyjny tj. cukrzyca, nadciśnienie, choroby reumatyczne, dermatologiczne, psychiatryczne (ze schizofrenią na czele).

W obszarze pańskich zainteresowań leży też zjawisko samobójstwa.

Zajmujemy się samobójstwem, ponieważ, ogólnie mówiąc,  nie jest ono oznaką zdrowia. Najczęściej jest wynikiem jakiejś choroby plus predyspozycji do takiego typu zachowania. Jest po prostu ciekawe, żeby znaleźć geny, które uczestniczą w tych procesach. Powiązanie genu z chorobą jest istotne z punktu widzenia zrozumienia patomechanizmów. I rzeczywiście takie badania prowadzimy głównie koncentrując się na samobójstwie, choć badamy też chorobę Gravesa (częsta choroba tarczycy), cukrzycę typu drugiego, choroby reumatyczne (reumatoidalne zapalenie stawów) i choroby alergiczne.

Jakie wyniki i efekty tych badań byłyby dla pana satysfakcjonujące?

Chciałbym, żeby w Polsce rozpowszechniła się metoda sekwencjonowania drugiej generacji, na tyle, aby była rutynowo stosowana w diagnostyce chorób genetycznych. Jestem pod jej olbrzymim wrażeniem. Oczywiście koszt jednego badania to  ok. 5 tysięcy zł , ale jest to jednorazowy wydatek, który często załatwia sprawę definitywnie, stosunkowo niskim nakładem pracy. Dlatego wbrew pozorom jest to metoda bardzo ekonomiczna. Biorąc pod uwagę koszty badań klasycznych, dziesiątki godzin poświęconych na konsultacje, diagnostykę i dywagowanie, to to według mnie w ogóle nie ma porównania. Pięć tysięcy złotych to jest rozsądna cena, za którą można by robić te badania na szeroką skalę. Nie śni mi się nawet, żeby NFZ dzisiaj to finansował. W Stanach to badanie kosztuje ponad 8 tysięcy dolarów i nie ma żadnego problemu z jego refundowaniem w uzasadnionych przypadkach, bo wszyscy stwierdzają, że to się opłaca  w sposób uderzający. To jest nowa jakość w diagnostyce. To jest technika niesamowicie potężna, wręcz reolucyjna!

Na którym obszarze terapeutycznym zależy panu najbardziej?

Największym wyzwaniem są nowotwory. W onkologii istnieje największa możliwość przełożenia prawidłowej diagnozy na przedłużenie życia. A druga dziedzina w sumie bardzo bliska nowotworom to choroby genetyczne, oczywiście te klasyczne.  Wciąż wiele z nich pozostaje nierozpoznawanych, mimo że są znane gany i wszystkie objawy.

Jakie są największe przeszkody w prowadzeniu analiz sekwencjonowania całogenomowego?

Bardzo ważnym narzędziem w interpretacji tych wyników jest możliwość odsiewania zmian, które nie są chorobotwórcze. Tych zmian jest zawsze dużo. W przypadku chorób gdzie gen jest nieznany i nie wiemy czego szukamy, to olbrzymim wyzwaniem jest odsianie zmian, które są przypadkowe, niezwiązane z chorobą. Zmiany takie mogą być rzadkie, mogą mieć pozory patogenności natomiast w rzeczywistości mogą nie mieć z chorobą nic wspólnego. Najbardziej jednoznacznym, prostym i bezdyskusyjnym narzędziem do odsiewania tych zmian jest po prostu duża baza danych populacji osób zdrowych, w szczególności bez danej choroby. Dzięki temu jesteśmy w stanie ustalić co znajduje się w naszej populacji . Przygotowanie takiego narzędzia to spory wydatek, ponieważ trzeba zbadać jakąś grupę osób zdrowych, następnie wyniki starannie opracować. Samo korzystanie z bazy nie byłoby skomplikowane. Po prostu sprawdzali byśmy jak często dany wariant genu wystąpił u osób zdrowych. Baza jest problemem, bo trzeba ją sfinansować, a nie można zastąpić polskiej bazy bazami zagranicznymi, ponieważ my jesteśmy jednak różni i są warianty, które są u nas w miarę częste, a w bazach zachodnich, amerykańskich, azjatyckich bywają bardzo rzadkie.

Czyli pojawia się jeszcze problem finansowania tych badań?

Środków nigdy nie ma za dużo, zwłaszcza przy tak kosztownym sprzęcie i technologii. Te pieniądze, zatem są bardzo potrzebne. Jednak jak się później patrzy z perspektywy rozwiązanych przypadków, to nie ma wątpliwości, że to warto tą drogą iść. 

Trzymam kciuki za sukces Pańskich badań i życzę powodzenia. Dziękuję za rozmowę.

Rozmawiał red. Tomasz Sznerch

pomoc w przygotowaniu tekstu - Anna Krawiec

***

Prof. dr hab. med. Rafał Płoski, absolwent Akademii Medycznej w Warszawie, gdzie uzyskał tytuł lekarza (1990); tytuł doktora n. med. otrzymał na Uniwersytecie w Oslo (1995). Zainteresowania prof. Płoskiego dotyczą zróżnicowania genetycznego człowieka w kontekście problematyki medycznej, antropologicznej oraz zagadnień związanych z identyfikacją osobniczą na potrzeby medycyny sądowej. Dorobek naukowy prof. Płoskiego to ponad 100 prac opublikowanych w piśmiennictwie międzynarodowym, które łącznie były cytowane około 2200 razy. Obecnie prof. Płoski kieruje zespołem Zakładu Genetyki Medycznej WUM, a jego działalność koncentruje się na zastosowaniu najnowocześniejszych technik wysokoprzepustowego sekwencjonowania DNA w diagnostyce medycznej. Istotna część realizowanych projektów dotyczy wykorzystania tych metod do wykrywania mutacji prowadzących do powstania nowotworów.