Walijscy naukowcy pracujący nad stworzeniem biosensora wykrywającego śladowe ilości aromatycznych nitrozwiązków (składniki materiałów wybuchowych), opracowali metodę bezpośredniej immobilizacji enzymu na powierzchni elektrody, bez potrzeby nakładania ochronnych „filmów”- samoorganizujących się monowarstw, czy też polimerów przewodzących. W tym celu metodami inżynierii genetycznej skonstruowano wektor ekspresyjny niosący wstawkę DNA składającą się z sekwencji natywnego genu nitroreduktazy bakteryjnej (nfnB) jak i doczepioną sekwencję kodującą tandem 6 cystein na N-końcu enzymu (6-Cys tag). W pierwszym etapie sekwencję (amplifikowaną za pomocą PCR) genu nfnB pochodzącą ze szczepu E.coli K12 wstawiono do wektora ekspresyjnego pET28a(+) otrzymując w ten sposób plazmid pCDG1. W plazmidzie tym gen znajdował się pomiędzy miejscami restrykcyjnymi BamH1 i HindIII. Następnie przygotowano startery dla drugiej reakcji PCR tak aby wygenerowany został „tag” cysteninowy na N-końcu białka. Pierwszy z primerów – starter nfnB-1 zorientowany 5’-3’ zawierał kolejno: sekwencję rozpoznawalną przez enzym restrykcyjny BamH1, sekwencję (3xTGTTGC) sześciu kodonów dla cysteiny, i sekwencję komplementarną do 5’ końca natywnego genu nfnB – sklonowanego we wspomnianym plazmidzie pCDG1. Drugi starter – nfnB-2 zorientowany 3’-5’ zawierał kolejno: sekwencję rozpoznawalną przez enzym restrykcyjny Hind3 i sekwencję komplementarną do 3’ końca genu nfnB sklonowanego w pCDG1. Reakcję PCR z tak zaprojektowanymi starterami prowadzono w środowisku oczyszczonego plazmidu pCDG1. Uzyskany amplikon potraktowano enzymami BamH1 i HindIII, a „wytrawioną” sekwencję DNA 6-Cys-gen-nitroreduktazy wstawiono do wektora pET-28(+), którym następnie stransformowano E.coli DH5a uzyskując plazmid pMKS2. W celu uzyskania wysokiej ekspresji białka – (6-Cys)-nitroreduktazy plazmid ten oczyszczono, następnie stransformowano nim bakterie E.coli (szczep Rosetta), a te z kolei hodowano na pożywce zawierającej IPTG (izopropylo-b-D-1-tiogalaktopiranozyd uruchamia system ekspresji przez związanie się do represora laktozowego, co powoduje jego inaktywację – regulacja allosteryczna represora). Uzyskawszy zrekombinowany enzym posiadający sześć reszt cysteiny na N-końcu białka, autorzy pracy immobilizowali biokatalizator na powierzchni elektrody wykonanej ze złota. Specjalnie dołączone „tagi” umożliwiły unieruchomienie enzymu w bezpiecznej odległości od elektrody bez utraty jego aktywności (bezpieczne centrum katalityczne enzymu). Ponieważ nitroreduktaza (NTR) jest dimerem, to funkcjonalny enzym może związać się 12 wiązaniami kowalencyjnymi, tilowymi (Au-S) z elektrodą. Walijscy naukowcy testowali aktywność i specyficzność substratową zrekobinowanego enzymu wobec różnych aromatycznych nitrozwiązków. Największą aktywność NTR obserwowano dla 2-etylofenyloazotanu, 1,2-dinitrobenzenu i 2,4-dinitroetylobenzenu. Istotnym z przeprowadzonych badań był pomiar aktywności enzymu poddanego immobilizacji na elektrodzie. Badanie to prowadzono w obecności 2,4-dinitroetylobenzenu jako substancji oznaczanej, NADH i FCD (ang. Ferrocene Dicarboxylic Acid) jako kofaktorów, które pełniły rolę odwracalnych przenośników redox pomiędzy centrum katalitycznym nitroreduktazy FMN – mononukleotydem flawinowym, a elektrodą. Wykazano porównywalną aktywność NTR jak i zasadność stosowania FCD zamiast NADH. Badanie elektrochemiczne, przy przyłożonym potencjale 100 mV (względem elektrody referencyjnej SCE) wykazało, że dodatek 2,4-dinitroetylobenzenu powoduje gwałtowny spadek natężenia spowodowany redukcją jonów ferrocenu produkowanych przez immobilizowaną nitroreduktazę. Przy czym zjawiska tego nie obserwowano w układzie pod nieobecność bądź to nitroreduktazy czy też mediatora elektronów FCD. Uzyskane wyniki pozawlają optymistycznie spoglądać na biosensory jako detektory śladowej ilości analitu. Ponieważ redukcji wszelkich warstw pośredniczących na drodze enzym-elektroda towarzyszy zwiększanie czułość pomiarów.


Biosensors and Bioelectronics 22 (2007) 2869-2875.