Czy mógłby Pan przybliżyć czytelnikom na czym polega innowacyjność MSSCP?

Jest to rozwinięcie klasycznej metody genotypowania opartej o natywną elektroforezę przestrzennych konformerów jednoniciowych cząsteczek DNA. SSCP jest to klasyczna metoda opracowana przez profesora Oritę w Japonii ponad 15 lat temu. Metoda ta pozwala  wykryć w badanym fragmencie DNA obecność dowolnej mutacji na podstawie zmiany ruchliwości elektroforetycznej jego przestrzennego konformeru. W tych samych warunkach, w czasie jednej elektroforezy, jeśli jedna cząsteczka jest od drugiej wyżej lub niżej, sygnalizuje to  wystąpienie różnic w sekwencji nukleotydowej pomiędzy nimi. W taki sposób, pośrednio, autorzy SSCP wnioskowali o wystąpieniu mutacji. Jeśli posiadamy próby od powiedzmy 20 pacjentów, 2 znane mutacje i wersję dziką, puszczamy w jednej studzience mutacje oraz wersję dziką, a w drugiej próbki. Od wysokości, na której ustawiają się badane cząsteczki zależy, jaki wykryjemy w nich wariant genetyczny. Jeśli jakaś cząsteczka ustawi się w innym miejscu niż pozostałe, oznacza to wykrycie nowej mutacji. Taki zmieniony prążek można wyciąć z żelu i  poddać reamplifikacji, sekwencjonować. Jest to niezwykle czuła (do 0,1%) metoda odkrywania nowych, nieznanych wcześniej wariantów genetycznych . Podsumowując, tego rodzaju metody, łączące cechy analityczne i preparatywne pozwalają na jednoczesną detekcję znanych oraz odkrywanie nowych, nieznanych wariantów genetycznych obecnych w badanej próbie nawet jako mniejszościowe domieszki. Jest to olbrzymia wartość. 

My tą metodę zmieniliśmy. Mianowicie jako jedyni na świecie w trakcie elektroforezy zmieniliśmy temperaturę żelu w sposób skokowy wg określonego schematu i dzięki temu podnieśliśmy prawdopodobieństwo wykrycia mutacji oraz znacznie skróciliśmy czas analizy. Może się bowiem zdarzyć, że pomiędzy cząsteczkami migrującymi w żelu z taką samą prędkością będzie różnica jednego nukleotydu, a kształt i opory ruchu będą identyczne. W metodzie SSCP otrzymalibyśmy wtedy fałszywie ujemne wyniki. Żeby to prawdopodobieństwo zmniejszyć, naukowcy na całym świecie analizowali w różnych warunkach, np. temperaturowych, te dwie cząsteczki - powiedzmy raz w 15, raz w 30, raz w 40 stopniach, czyli trzy żele, cztery żele, pięć żeli. Jeśli puścili cząsteczki w pięciu żelach i one zawsze migrowały z taką samą prędkością, stwierdzali, że na pewno nie ma mutacji. My zbudowaliśmy urządzenie, które nazywa się DNA Pointer i które pozwala nam zmieniać temperaturę w trakcie elektroforezy. Potrafimy chyba najdokładniej na świecie stabilizować temperaturę żelu w trakcie elektroforezy. Kontrolujemy  temperaturę prób w żelu z dokładnością do 0,1 stopnia. A to pozwala nam zmieniać ją np. o 5 stopni z bardzo dużą powtarzalnością i dokładnością.

Jakie są możliwości zastosowania  MSSCP?

Okazało się, co nas zaskoczyło i na co dostaliśmy patent nawet w amerykańskim urzędzie patentowym,  że zmieniając temperaturę w naszym urządzeniu wykrywamy więcej różnic genetycznych w badanym materiale aniżeli prowadząc badania np. w trzech różnych żelach, w trzech oddzielnych temperaturach. My wykrywaliśmy 9 różnic, a w trzech oddzielnych żelach wykrywano 6 różnic. Podnieśliśmy wykrywalność, czy też zmniejszyliśmy fałszywie ujemne wyniki o 20%. Jest pewna cecha fizykochemiczna, która powoduje, że jeżeli zmiany temperatury dokonujemy w trakcie elektroforezy, to ujawnia się więcej zmian w ruchliwości elektroforetycznej niż gdybyśmy to samo robili w tych samych trzech czy też pięciu ale oddzielnych elektroforezach.

To, co jest istotne dla użytkownika, to czas. My tą samą elektroforezę, co profesor Orita przeprowadzamy w półtorej godziny, a nie w kilka dni i mamy o 20% większą wykrywalność. Był to główny powód, dla którego zespoły naukowe zainteresowały się MSSCP. Przepustowość DNA Pointera pozwala spokojnie analizować do 100 prób dziennie. 

Jeden z profesorów uniwersytetu pod Rzymem po zakupie DNA Pointera, zwrócił nam uwagę, że MSSCP pozwala wykryć obecność w badanym materiale mniejszościowych wariatów genetycznych na zdecydowanie niższym poziomie aniżeli np. metoda sekwencjonowania DNA Sangera, a także NGS. Taki rodzaj prób występuje w onkologii, przy gentopowaniu biopsji z guzów litych. Oddzielnym problemem diagnostycznym w przypadku badania guzów litych jest niepełna reprezentatywność materiału w biopsji dla całego guza. Problem polega na tym, że materiał z biopsji zawiera w różnych proporcjach ilościowych komórki z np. mutacją w wybranym genie markerowym, bez mutacji lub z dwoma, trzema różnymi wariantami mutacji. W tym mogą się znajdować nowe i nieznane warianty genetyczne. Po namnożeniu metodą PCR rejonu kodującego wybrany marker genetyczny np. determinujący lekowrażliwość  lub lekooporność, otrzymujemy w jednej probówce mieszaninę różnych genetycznych wariantów tego samego genu i na dokładkę w różnych proporcjach ilościowych. Zastosowanie np. metody  Sangera dla takich próby pozwoli wykryć w niej obecność dominującego ilościowo wariantu genetycznego ale nie zauważymy znajdującego się w tle na poziomie poniżej 10% np. wariantu lekoopornego. Otrzymujemy wtedy ujemnie fałszywe wyniki, mówiące, że mutacji nie ma, chociaż mutacja jest, ale poniżej poziomu wykrywalność zastosowanej procedury/metody diagnostycznej. Jednak gdy namnożone komórki rozdzielimy na żelu MSSCP, pojawią się dwa prążki, jeden nad drugim. Gdy je wytniemy i namnożymy PCR w dwóch oddzielnych probówkach, a potem zsekwencjonujemy, otrzymamy dwie „czyste” sekwencje Sangera - lekowrażliwą i lekooporną, niezależnie od tego, że jednej z nich może być sto, a drugiej pięć milionów kopii w materiale pobranym od pacjenta. Zdarzały nam się takie próby, gdzie za pomocą MSSCP znajdowaliśmy 5, 6 wariantów genetycznych w jednej próbie onkologicznej.

Rozwiązanie takiego problemu diagnostycznego, zarówno w onkologii, jak i w wirusologii, na tym poziomie wykrywalności znanych i nieznanych wariantów genetycznych jednocześnie jest nie do osiągnięcia żadną inną metodą w porównywalnej skali czasowej i kosztowej. Wykorzystując metodę MSSCP jako pierwsi na świecie pokazaliśmy również, że wirus grypy, kiedy zakaża człowieka i replikuje, niekoniecznie replikuje jako homopopulacje, ale jako heteropopulacje. Później te heteropopulacje zakażają następnego człowieka itd. Jako pierwsi na świecie wykryliśmy obecność dwóch różnych wariantów genetycznych wirusa grypy (sezonowy i pandemiczny H1N1) u tego samego pacjenta w tym samym czasie. [...] Jest to unikalna w skali świata wartość MSSCP.

Metodę MSSCP można także wykorzystać do analiz meta genowych. Przykładem jest np. analiza występowania szczepów bakteryjnych w izolatach bakterii z gardła. Powszechnie wiadomo, że nie wszystkie szczepy bakteryjne rosą na podłożach in vitro. Szacuje się że w niektórych przypadkach może to być tylko 20%, a  80%  nie rośnie. Posiewem mikrobiologicznym jesteśmy więc w stanie zidentyfikować tylko maksymalnie te 20%. Drugie podejście jest takie, że z próby klinicznej (np. wymaz) izolujemy całkowity materiał genetyczny bakteryjny, amplifikujemy określone konserwowane regiony genomu bakteryjnego (np. kodujące 16SRNA)  i rozdzielamy te produkty PCR na żelu MSSCP. Mamy wówczas możliwość identyfikacji szybszej i większej liczby szczepów bakteryjnych występujących w próbie klinicznej niż na podstawie posiewu mikrobiologicznego.

Czy zainteresowanie DNA Pointerem jest duże wśród klientów Biovectis?

Sprzedaliśmy DNA Pointery głównie w kraju, ale także w Berlinie, w Rzymie, prezentowaliśmy w Anglii, w Szwecji, USA. Wysokie zainteresowanie jest oczywiście w Polsce. Dla przykładu Zespół prof. Chocimskiej z Międzynarodowego Instytutu Biologii Molekularnej i Komórkowej w Warszawie kupił dwa DNA Pointery i zaskoczył nas tym zupełnie. Zespół wykorzystał te urządzenia nie do genotypowania, ale do specyficznej i powtarzalnej analizy natywnych kompleksów białkowych. To zastosowanie umożliwiła  unikalny w skali świata poziom regulacja temperatury prób w żelu.

Dziękuję za rozmowę.