Łańcuchowa reakcja polimerazy (PCR) od wielu lat stanowi użyteczne narzędzie biologii molekularnej służące do badań na poziomie genu. Wysoka czułość techniki PCR, jak również stale rosnąca liczba nowych rozwiązań udoskonalających sprawiają, że zastosowana w połączeniu z metodami detekcji białek może zwiększyć ich specyficzność (np. immuno-PCR). Jak zwraca uwagę Prof. Liansheng Ling z Sun Yat-Sen University w Chinach niespecyficzna amplifikacja podczas reakcji PCR jest nieunikniona i może utrudnić analizę wyników. Dlatego niezwykle istotną kwestią pozostaje metoda identyfikacji właściwego produktu.

– Każdego roku powstaje tysiące publikacji na temat specyficznego wobec danej sekwencji rozpoznawania ssDNA, natomiast liczba publikacji dotyczących detekcji dsDNA wynosi poniżej 20 (...) - mówi Prof. Ling w komentarzu udzielonym dla naszego portalu.

Naukowcy postanowili  stworzyć system detekcji białek wspomagany przez reakcję PCR, której dwuniciowy produkt wykrywany jest dzięki wytworzeniu trypleksu DNA ze znakowaną fluorescencyjnie sondą typu molekularnej latarni. Struktura trójniciowego DNA jest strukturą wyższego rzędu. Jej powstanie wiąże się ze zmianami konformacyjnymi w obrębie dwuniciowego DNA, które z kolei umożliwiają zasocjowanie trzeciego łańcucha.

Powstanie trypleksu uwarunkowane jest występowaniem dwuniciowej sekwencji o charakterze homopurynowo-homopirymidynowym.  Trójniciowe DNA powstaje poprzez przyłączenie sekwencji komplementarnej (najczęściej homopirymidynowej) do jednej z nici dupleksu. Trwałość struktury wymaga pełnej komplementarności zasad azotowych w obrębie wszystkich nici DNA wchodzących w skład trypleksu.

Swoje doświadczenia naukowcy skupili na detekcji trombiny, czyli  II czynnika krzepnięcia, odpowiedzialnego za przekształcenie fibrynogenu  w fibrynę. Zaprojektowane zostały dwa oligonukleotydy, tzw. A i B, w obrębie których znajdowały się sekwencje stanowiące aptamery dla wybranego białka. W obecności trombiny komplementarne fragmenty oligonukleotydów A i B ulegały hybrydyzacji, a następnie sekwencja oligonukleotydu B była wydłużana w obecności  Fragmentu Klenowa i dNTP. W następnej kolejności amplifikowano uzyskany fragment dwuniciowej cząsteczki DNA wykorzystując metodę PCR.

Produkt reakcji wykrywano natomiast przy użyciu sondy typu molekularnych latarni. Są to oligonukleotydy posiadające na końcu 5' cząsteczkę fluorochromu (tzw. reporter), a na końcu 3' cząsteczkę wygaszająca fluorescencję reportera. Sonda wiązała się do dwuniciowego DNA tworząc strukturę trypleksu i jednocześnie dawała sygnał fluorescencyjny, ponieważ cząsteczka wygaszająca fluorescencję została po zasocjowaniu sondy oddzielona od cząsteczki fluorochromu. Pomiary intensywności fluorescencji po hybrydyzacji sondy wykazały wysoką efektywność zastosowanej metody.

– W naszych badaniach wykrywaliśmy produkt PCR poprzez wytworzenie jego trypleksu z molekularną latarnią, co eliminuje sygnał pochodzący z niespecyficznej amplifikacji DNA i pozwala rozszerzyć zakres wykorzystania trójniciowego DNA - zwraca uwagę Prof. Ling - Może to również zachęcić naukowców do badań na temat  struktury trypleksów w przyszłości.