Proces RNAi zostaje zainicjowany w cytoplazmie w momencie pojawienia się długich dwuniciowych cząsteczek RNA (dsRNA) lub cząsteczek RNA o strukturze „spinki do włosów” (shRNA – z ang. short hairpin RNA). Cząsteczka dsRNA niezależnie od jej sekwencji rozpoznawana jest i hydrolizowana przez nukleazę Dicer. Produktem trawienia dsRNA są krótkie, dwuniciowe interferujące siRNA, o długości 21-23 nukleotydów, zakończone dwoma wolnymi nukleotydami na końcu 3’ [1].

Powstałe siRNA wraz z wyciszającym kompleksem RISC uczestniczą w reakcji degradacji homologicznego mRNA. Kompleks RISC wiąże preferencyjnie jedną z nici siRNA. Analizy biochemiczne i bioinformatyczne wskazują na to, że sekwencja i struktura siRNA decyduje o tym która z nici zostanie związana z RISC [2]. Jednoniciowy siRNA łączy się na zasadzie komplementarności z docelową sekwencją mRNA. Endonukleaza Ago2 (wchodząca w skład RISC) przecina powstałe dupleksy mRNA/siRNA, a dalsza degradacja zachodzi pod wpływem działania egzonukleaz [3, 4]. Po zdegradowaniu docelowej cząsteczki RNA, RISC zostaje uwolniony i może być ponownie wykorzystany w procesie RNAi.

Niektóre z białek kompleksu RISC zostały odnalezione w połączeniu z białkami rybosomalnymi jak L5, L11, jak i z 5S rRNA, co nasuwa przypuszczenie, że proces interferencji RNA może wpływać także na etap translacji [5, 6, 7].

Pierwszym etapem wyciszenia ekspresji genu u ssaków z udziałem siRNA jest pocięcie długiego łańcucha dwuniciowego RNA. Cięcia tego dokonuje enzym Dicer, należący do RNazIII. Powstające krótkie łańcuchy RNA mają długość około 21 nukleotydów. Dicer działa jako monomer, a cięcia dokonuje poprzez dwie reakcje endonukleolityczne[8,9]. Zostało to potwierdzone w doświadczeniach, w których blokowano końce dwuniciowego RNA uniemożliwiając wiązanie się enzymu. W rezultacie reakcja cięcia dsRNA uległa znaczącemu zahamowaniu[9]. Po przyłączeniu się domeny PAZ do końca łańcucha RNA dwie domeny RNaseIII tworzą pseudodimer w taki sposób, że każda z nich związana jest z inną nicią RNA. Następnie następuje cięcie nici, a występowanie na nowych końcach dwóch dodatkowych niesparowanych nukleotydów jest spowodowane przesunięciem względem siebie miejsc katalitycznych na tych dwóch domenach, a długość powstających produktów, wynosząca około 21 nukleotydów determinowana jest wyłącznie odległością domeny PAZ od miejsc katalitycznych w domenach RNaseIII[8,10].

Dzięki oddziaływaniom między domenami PAZ Dicer i kompleksu RISC krótkie dwuniciowe RNA jest przekazywane na ten ostatni. Tu ulega rozpleceniu i z RISC związana pozostaje tylko nić antysensowna. Domena PAZ kompleksu RISC wiąże koniec 3’ natomiast koniec 5’ jest wiązany z domeną PIWI. Reszta kwasu fosforowego znajdująca się na końcu 5’ siRNA wiązana jest koordynacyjnie z trzema konserwatywnymi resztami aminokwasowymi[11] oraz występującym w domenie PIWI metalem i zostaje odciągnięta od mRNA. Miejsce aktywne domeny PIWI odpowiedzialnej za cięcie mRNA znajduje się w odległości 11nt od końca 3’[12], a od końca 5’ w odległości 10nt[11]. Daje to całkowitą długość jaką powinna charakteryzować się efektywna nić siRNA i jednoznacznie wyjaśnia dlaczego cząsteczki uczestniczące w RNAi muszą zostać pocięte przez Dicer na takie fragmenty.

Po przyłączeniu cząsteczki siRNA następuje przyłączenie docelowego mRNA i „zapada decyzja” o cięciu mRNA lub zahamowaniu translacji. To który scenariusz zostanie zrealizowany zależy od komplementarności pomiędzy obiema nićmi. Wysoki stopień komplementarności będzie pozwalał na cięcie natomiast niski stopień komplementarności będzie skutkował zahamowaniem translacji bez degradacji mRNA[13,14]. Cięcie nici mRNA zachodzi tylko, wtedy gdy obie nici są komplementarne na odcinku co najmniej jednego całkowitego skrętu helisy RNA, odpowiada to nukleotydom od 2 do 12 od końca 3’ nici siRNA[14]. Aktualnie rozpatrywane są dwie możliwości odnośnie samego cięcia nici mRNA. Pierwsza z nich zakłada, że aby dostać się do miejsca aktywnego domeny PIWI siRNA połączone z mRNA musi przyjąć odpowiednią strukturę drugorzędową. Druga koncepcja mówi, że mocne zakotwiczenie końców 5’ i 3’ pozwala na działanie nici siRNA jako czujnika tworzenia się obszernej helisy dsRNA. Ponieważ helisy RNA są dość sztywne tworzenie się takiej helisy powoduje przyciąganie domeny PAZ i PIWI przez siRNA. Powstające wtedy zmiany konformacyjne mogą pozwalać na cięcie nici mRNA[15]. Co ciekawe obie te koncepcje nie są względem siebie całkowicie wykluczające.

Bibliografia:
[1] Elbashir SM, Harborth J, Lendeckel W, Yalcin A, Weber K, Tuschl T, Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature 2001; 411: 494-498.
[2] Gong D, Ferrell JE, Picking a winner: new mechanistic insights into the design of effective siRNAs. Trends Biotech 2004; 22: 451-454.
[3] Liu J, Carmell MA, Rivas FV, et al., Argonaute2 is the catalytic engine of mammalian RNAi. Science 2004; 305: 1437-1441.
[4] Song JJ, Smith SK, Hannon GJ, Joshua-Tor L, Crystal structure of Argonaute and its implications for RISC slicer activity. Science 2004; 305: 1434-1437.
[5] Hammond SM, Boettcher S, Caudy AA, Koayashi R, Hannon GJ, Argonuate2, a link between genetic and biochemical analyses of RNAi. Science 2001; 293: 1147-1150.
[6] Gu S, Rossi JJ, Uncoupling of RNAi from active translation in mammalian cells. RNA 2005; 11: 38-44.
[7] Ishizuka A, Osimi MC, Siomi H, A Drosophila fragile X protein interacts with components of RNAi and ribosomal proteins. Genes Dev 2002; 16: 2497-2508.
[8] Zhang H, Kolb FA, Jaskiewicz L, Westhof E, Filipowicz W, Single processing center models for human Dicer and bacterial RNase III. Cell; 118, 57-58.
[9] Zhang H, Kolb FA, Brondani V, Billy E, Filipowicz W, Human Dicer preferentially cleaves dsRNAs at their termini without a requirement for ATP. The EMBO Journal 2002; 21, 5875-5885.
[10] Vermeulen A, Behlen L, Reynolds A, Wolfson A, Marshall WS, Karpilow J, Khvorova A, The contributions of dsRNA structure to Dicer specificity and efficiency. RNA 2005; 11, 674-682.
[11] Liu J, Argonaute2 is the catalytic engine of mammalian RNAi. Science 2004; 305, 1437-1441.
[12] Song JJ, Smith SK, Hannon GJ, Joshua-Tor L, Crystal structure of Argonaute and its implications for RISC slicer activity. Science 2004; 305, 1434-1437.
[13] Tang G, siRNA and miRNA: an insight into RISCs. Trends in Biochemistry Science 2005; 30, 106-114.
[14] Haley B, Zamore PD, Kinetic analysis of the RNAi enzyme complex. Nat.Struct.Mol.Biol. 2004; 11, 599-606.
[15] Collins RE, Cheng X, Structural domains in RNAi. FEBS Letters 2005; 579, 5841-5849.