Mikroskopia dwufotonowa jest techniką dość wiekową, jednak jej nowe możliwości wykorzystania sprawiają, że metoda ta stanowi obecnie doskonałe uzupełnienie we wszelkiego typu badaniach biologicznych. Początek idei techniki obrazowania dwufotonowego datuje się na rok 1931.
– W mikroskopii dwufotonowej wykorzystuje się fakt, że cząsteczka fluorochromu zdolna jest do zaabsorbowania jednocześnie dwóch fotonów, które wywołują jego fluorescencję - mówi Łukasz Fajfrowski, fizyk na co dzień pracujący w Międzynarodowym Laboratorium Silnych Pól Magnetycznych i Niskich Temperatur we Wrocławiu – Istotnym jest, że żaden z tych fotonów nie byłby zdolny do wywołania tego zjawiska "w pojedynkę" z uwagi na zbyt niską energię wzbudzenia.
Ogromną zaletą mikroskopii dwufotonowej jest możliwość analizy grubszych preparatów, jak również mniejsza fototoksyczność światła lasera. Pozwala to na analizę żywych komórek. Ponadto, zastosowanie dłuższych fal wzbudzających nie powoduje wyświecania fluorochromu - absorpcja dwufotonowa zachodzi jedynie w płaszczyźnie fokalnej (tj. w jednej płaszczyźnie ostrości). W przypadku badań w neurologii mikroskopia dwufotonowa stanowi niezwykle użyteczne narzędzie do zwizualizowania morfologii tkanek ex vivo i in vivo oraz badania dynamiki działania sieci neuronowych.
Oczywiście kluczowym elementem tej techniki jest obecność specyficznej fotostabilnej cząsteczki fluoryzującej. Niestety, większość białek fluorescencyjnych czy też organicznych fluoroforów podlega tzw. procesowi fotowybielania, co sprawia, że nie nadają się one do długotrwałego procesu obrazowania. Jak się jednak okazuje można ominąć ten problem. Naukowcy wykorzystali zjawisko emisji indukowanej agregacją (AIE, ang. agregation induced emission) i w celu wizualizacji określonych obiektów zastosowali luminogen - bromek tetrafenyloeteno-bis-(trifenylofosfoniowy) (TPE-TPP, ang. tetraphenylethene-triphenylphosphonium).
Cząsteczki TPE-TPP wykazują silną fluorescencję jedynie w przypadku formowania agregatów. Maksimum fluorescencji tych struktur, w środowisku wodnym, wynosi 480 nm (przy długości fali wzbudzenia = 320 nm). Stanowi to przeciwieństwo znanego dla niektórych cząsteczek efektu wygaszania fluorescencji (ACQ, ang. aggregation-caused quenching), które towarzyszy ich agregacji. Molekuły wykazujące AIE mogą być enkapsułowane w różnego typu nanocząstki.
Są one odporne na fotowybielanie, nawet w przypadku użycia promieniowania laserowego o znacznej mocy, co pozwala na ich zastosowanie podczas długotrwałego obserwowania preparatu. Wcześniejsze badania wykazały, że TPE-TPP może być z powodzeniem wykorzystany do wizualizacji mitochondriów. Ostatnie doświadczenia, których wyniki przedstawiono w czasopiśmie Biomedical Optics Express wskazują na zastosowanie TPE-TPP w barwieniu pierwotnej hodowli neuronów (in vitro) lub komórek mikrogleju in vivo.
Otrzymane rezultaty ukazują wysoką aplikacyjność TPE-TPP w aspekcie długotrwałego obrazowania w neurologii. Potwierdza to istotę zagadnienia emisji indukowanej agregacją, które jest obecnie prężnie rozwijane, zarówno pod względem syntezy nowych organicznych układów, jak również zastosowania w branży medycznej.
KOMENTARZE