W rozmowie z naszym portalem, dr Robert Gromadka, kierownik Pracowni Sekwencjonowania DNA i Syntezy Oligonukleotydów w Instytucie Biochemii i Biofizyki PAN opowiada o ponad 20 letniej historii działania Pracowni, oraz o tym co i jak sekwencjonują polscy naukowcy.

Skąd wziął się pomysł aby otworzyć Serwis Sekwencjonowania i Syntezy DNA oligo.pl?

Powstanie serwisu odbyło się drogą „ewolucji naturalnej”. Ponad 20 lat temu. Dzięki inicjatywie profesora Włodzimierza  Zagórskiego, zakupiono dla Instytutu syntetyzer oligonukleotydów i pierwszy nieradioaktywny sekwenator. W ramach współpracy z prof. A. Słonimskim, pracującym w Centrum Genetyki Molekularnej w Gif-sur-Yvette pod Paryżem, przystąpiliśmy do międzynarodowego projektu sekwencjonowania  pierwszego genomu eukariotycznego organizmu, drożdży Saccharomyces cerevisiae. Wtedy, w czasie trwania 3 letniego grantu udało się nam ustalić sekwencję o długości około 12,5k pz. Robi to trochę skromne wrażenie, skoro teraz możemy w ciągu nocy wykonać sekwencjonowanie kilku całych genomów bakteryjnych o długości każdy 3-5 milionów par zasad. W miarę rozwoju techniki, przystępując do kolejnych projektów, wymienialiśmy naszą aparaturę na coraz nowszą dającą większą przepustowość. Po projekcie drożdżowym pojawił się projekt sekwencjonowania największego chromosomu pantofelka, Paramecium tetraurelia, a później kiedy pojawiły się pierwsze aparaty nowej generacji projekt poznania całego genomu ziemniaka. Sekwencjonowanie przestało być celem samym w sobie, a stało się narzędziem poznawczym i punktem wyjścia do dalszych analiz. Ponieważ Pracownia miała doświadczenie i możliwości zaczęła współpracować z wieloma  naukowcami, najpierw w swoim Instytucie, a później w placówkach naukowo‑badawczych i diagnostycznych w Polsce.

Państwa działalność nie jest działalnością komercyjną nastawioną na osiągnięcie zysku. Skąd takie podejście? Czy nigdy nie kusiło Państwa, aby choć część badań przeprowadzać na warunkach komercyjnych?

Pracownia w ramach obowiązków służbowych wykonuje swoje usługi niekomercyjnie na potrzeby realizacji projektów badawczych prowadzonych w Instytucie Biochemii i Biofizyki. Funkcjonuje jako tak zwany „core lab”. Jednocześnie z naszych usług mogą korzystać inne instytucje w Polsce i zagranicą na zasadach komercyjnych. Jako usługodawca uczestniczymy także w przetargach.

Czy wśród klientów oligo.pl są rzeczywiście tylko naukowcy z innych instytutów badawczych? Czy pojawiają się zamówienia np. z firm biotechnologicznych?

Tak, poza instytutami naukowymi zwracają się do nas również firmy biotechnologiczne jak również z innych gałęzi przemysłu, np. spożywczego. Instytut posiada bardzo duży i różnorodny potencjał naukowy, dzięki czemu Pracownia może w każdej chwili znaleźć potrzebną pomoc przy rozwiązywaniu stawianych przed nami zadań.

Jakie metody sekwencjonowania są wykorzystywane przez Państwa zespół?

Oczywiście nadal w szerokim stopniu, szczególnie w diagnostyce, wykorzystywane jest klasyczne sekwencjonowanie metodą Sangera, ale już nie w wersji radioaktywnej. W pracowniznajdują się trzy aparaty do sekwencjonowania kapilarnego o różnej przepustowości próbek, 96, 48 lub 4 równocześnie.Od 2008 roku posiadamy pierwszy uruchomiony w Polsce aparat do sekwencjonowania nowej generacji firmy Roche, GS FLX + Titanium. Jego zakup był związany z uczestnictwem w Międzynarodowym Konsorcjum Sekwencjonowania Genomu Ziemniaka. W tym czasie był to aparat pozwalający uzyskać najdłuższe odczyty przy masowym sekwencjonowaniu. Po ostatnich zmianach konstrukcyjnych i oprogramowania możliwe jest otrzymywanie odczytów o średnich długościach 700-800pz. Dzięki współpracy z innymi Pracowniami w Instytucie mamy również dostęp do innego typu sekwenatora nowej generacji, MiSeq firmy Illumina.

Która z metod jest najbardziej wydajna?

Nie ma uniwersalnej metody, idealnej na każdą okazję. Każdy większy projekt to indywidualne planowanie. Jeżeli ktoś konstruuje plazmid do nadprodukcji jakiegoś białka, to poprawność kodującej sekwencji będzie sprawdzał sekwencjonując klasyczną metodą Sangera. Jeżeli badamy bioróżnorodność na podstawie sekwencji 16S/18S rDNA, to użycie GS FLX będzie najlepszym rozwiązaniem. Otrzymamy dużo długich odczytów, pozwalających na, w miarę dostępnych sekwencji w bazach danych, dokładne przypisanie do gatunków czy rodzajów badanej mieszaniny mikroorganizmów. W przypadku oznaczania precyzyjnego sekwencji DNA szczepów patogennych znowu wrócimy do metody Sangera i sekwencjonowania 4-7 locii (metoda ang. Multi LocusSequence Typing MLST). Jeżeli chcemy poznać sekwencję całych genomów to oczywiście połączenie sekwencjonowania GS FLX, długie odczyty tworzące szkielet, i MiSeq, krótkie, ale tanie, będzie najlepszym podejściem. Na koniec pozostaje jeden największy problem. Jak zinterpretować, wykorzystać, uzyskane wyniki. Wszystkie metody sekwencjonowania nowej generacji są bardzo wydajne w dostarczaniu surowych danych, ale później potrzebne są dobre programy, wydajne komputery i przede wszystkim bioinformatycy, którzy będą potrafili te dane wykorzysta i właściwie zanalizować.

Czy próbki do sekwencjonowania są zawsze idealne? Jakie są najbardziej popularne błędy klientów?

Niestety nie. Kiedyś DNA było izolowane metodami opartymi na przygotowywanych samodzielnie odczynnikach i do sekwencjonowania były niezbędne duże ilości DNA. Obecnie dzięki rozwojowi różnych technik, naukowcy dostają do swoich rąk gotowe zestawy do izolacji DNA. Powoduje to, że wielu z nich wychodzi z założenia, skoro firma gwarantuje izolację czystego DNA, to na koniec jest czyste DNA i w dużej ilości. Niestety zależy to od dokładności przestrzegania procedury i czasami rodzaju materiału z którego jest izolowane DNA. Zdarzało się, że osoby przynoszące DNA pokazywały zdjęcie i mówiły, że ono tam naprawdę jest i proszę je sekwencjonować, mimo, że nikt go na zdjęciu nie widział. Czasami i z takich duchów udawało się uzyskać sekwencje.

Co sekwencjonuje się u Państwa najczęściej? Czy sekwencjonowanie może mieć potem jakieś aplikacyjne zastosowanie, czy raczej czysto naukowe?

Najczęściej obecnie sekwencjonowane są krótkie produkty PCR. Nie prowadzimy statystyk, co aktualnie interesuje naszych zleceniodawców, więc trudno powiedzieć czy są to sekwencje związane z chorobami genetycznymi ludzi czy materiał pochodzi z innych organizmów. Każde badanie podstawowe, służące poznaniu, poszerza wiedzę, i może w późniejszym okresie stać się podstawą do zastosowania w np. diagnostyce i nabrać wymiaru aplikacyjnego.

Od 11 lat prowadzicie Państwo minigranty. Czy można dowiedzieć się czegoś więcej o tym przedsięwzięciu?

Pomysł minigrantów powstał jako możliwość bezpośredniego wspomagania prac naukowych dotyczących chorób genetycznych. Wysokość tych grantów jest zbyt mała, żeby z ich pomocą stworzyć już sprawdzoną metodę diagnostyczną, ale pozwalają na uzyskanie wyników wstępnych, z którymi można aplikować o duże granty naukowe. W ostatnim okresie wspomagamy również działalność studenckich kół naukowych. Reprezentacja Uniwersytetu Warszawskiego na konkursie iGEM organizowanym przez Massachusetts Institute of Technology w Bostonie (USA) w kolejnych latach zajmowała pierwsze i drugie miejsca, zbierając liczne pochwały zarówno gremium sędziowskiego jak i innych uczestników konkursu.

Czy któryś z nagrodzonych darmowych sekwencjonowań rzeczywiście przyczyniło się do ulepszenia analityki medycznej lub diagnostyki chorób?

Tego typu badania, zanim wejdą na stałe do kanonów diagnostycznych muszą być zweryfikowane i to wymaga znacznych nakładów finansowych i czasu. Z tego powodu nie mogę wskazać konkretnie jednego wyniku sekwencjonowania, który spowodowałby rewolucję w diagnostyce i dał cudowne narzędzie następnego dnia, ale wierzę, że suma wyników osiągniętych między innymi przy  wykorzystaniu naszych minigrantów w przyszłości dostarczy podstaw do opracowania skutecznych i prostych metod diagnostycznych.

Jak podążają Państwo za dynamicznie zmieniającymi się trendami naukowymi?

Przyglądamy się wszystkiemu bardzo uważnie, ale też i lekko sceptycznie. Staramy się wykonywać naszą pracę rzetelnie nie biegnąc od jednej nowinki do drugiej. To już od osób zlecających nam analizy DNA zależy jak zostaną te wyniki wykorzystane.

Jakie są dalsze perspektywy i plany Pracowni Sekwencjonowania i Syntezy DNA?

Pomimo rozwoju aparatury prowadzącej do uproszczenia uzyskiwania informacji o sekwencji DNA, myślę, że nadal w wielu przypadkach dla naukowców łatwiej będzie skorzystać z naszej pomocy niż samemu wykonywać sekwencjonowanie. Utrzymywanie aparatury z której korzysta się raz na kilka miesięcy nie ma sensu, a do nas zawsze można przyjść z próbkami, bo codziennie wykonujemy kilkadziesiąt, czasem kilkaset, reakcji sekwencjonowania. I bardzo chętnie pomożemy przy problemach, bo w ciągu tylu lat mieliśmy kontakt z bardzo różnymi rodzajami materiałów i organizmów z których było izolowane DNA do sekwencjonowania. Z takich ciekawszych i trudniejszych przypadków to były na przykład kości niedźwiedzia jaskiniowego datowane na prawie 90 tysięcy lat p.n.e., a z bardziej współczesnych próbki metagenomiczne z lodowców na Spitsbergenie czy chodników w byłych kopalniach uranowych.

Dziękuję za rozmowę

Rozmawiał Tomasz Sznerch