Plazmidy są pozachromosomalnym materiałem genetycznym bakterii występującym w kolistej, zamkniętej postaci. Zawarta jest w nich informacja genetyczna, która nie jest niezbędna do przetrwania i nie warunkuje podstawowych procesów życiowych. Można wymienić tutaj między innymi: oporność na antybiotyki, produkcja toksyn, oporność na jony metali ciężkich. W metodzie lizy alkalicznej wykorzystuje się zdolność plazmidu do renaturacji przeprowadzonej po denaturacji, dzięki czemu możliwym jest oddzielenie go od DNA genomowego.

Nie będziemy tutaj przytaczać dokładnej procedury przeprowadzania tej metody, ponieważ każde laboratorium na dobrą sprawę dobiera odrobinę inne warunki. Celem artykułu jest przedstawienie ogólnej zasady i zasadności przeprowadzania poszczególnych etapów.

Oczywiście najpierw musimy wyhodować interesujące nas bakterie na podłożu płynnym. Zazwyczaj zaszczepia się pożywkę LB i inkubuje przez całą noc.

Następnie wirujemy hodowlę, aby móc pozbyć się nadmiaru pożywki, ponieważ interesujące nas DNA plazmidowe znajduje się jedynie w otrzymanym przez nas osadzie bakteryjnym, a jej resztki mogą blokować działanie niektórych enzymów. Warunki wirowania należy tak dobrać, aby komórki osadziły się na dnie probówki, lecz nie zbiły się nadmiernie, ponieważ potem ich liza zachodzi niecałkowicie, co obniża wydajność izolacji DNA plazmidowego.  

Osad bakterii zawieszamy w mieszaninie GTE, niektóre osoby dodają na tym etapie także lizozym.

Lizozym: jest to enzym hydrolityczny, który ma zdolność do rozkładania peptydoglikanu budującego ścianę komórkową bakterii. Prowadzi to do powstawania protoplastów

Glukoza: zapewnia odpowiednie ciśnienie osmotyczne w roztworze. Jest to szczególnie istotne, gdy wcześniej zastosujemy lizozym. Protoplasty są bardzo delikatne i wrażliwe na zmiany ciśnienia osmotycznego, a gdy komórki są umieszczone w roztworze hipotonicznym, może dojść do ich pęknięcia ze względu na nadmiar wody, którą pobiorą.

Tris: jest roztworem buforowym, który ma utrzymać stałe pH roztworu (ok.8)

EDTA: jest związkiem chelatującym jony dwuwartościowe (przede wszystkim jony wapnia i magnezu). Skutkuje to destabilizacją ściany komórkowej bakterii. Ponadto, chelatacja jonów Mg²⁺ skutkuje zahamowaniem funkcjonowania endogennych DNaz, czyli deoksyrybonukleaz (blokujemy możliwość pocięcia przez nie interesującego nas DNA).

Obecnie coraz więcej osób dodaje również RNazy (rybonukleazy) do roztworu, aby w późniejszym etapie oczyszczenie preparatu z RNA przebiegało w skuteczniejszy sposób.

Kolejnym etapem jest przeprowadzenie lizy komórek bakteriyjnych. W tym celu do zawiesiny bakteryjnej należy dodać mieszaniny SDS z NaOH.

SDS: jest to detergent (zmienia napięcie powierzchniowe osłon komórkowych), który rozpuszcza fosfolipidy i denaturuje białkowe struktury błon komórkowych, co z kolei prowadzi do lizy komórek i uwolnienia i zawartości do roztworu.

NaOH: zapewnia wysokie (alkaliczne) środowisko reakcji, co prowadzi do denaturacji DNA genomowego i plazmidowego. DNA plazmidowy występujący w formie CCC denaturuje tylko miejscami .

Następnie do lizatu należy dodać roztwór renaturujący składający się z kwasu octowego i octanu potasu. Zapewnia to kwaśne środowisko reakcji (pH ok. 5,5), dzięki czemu DNA plazmidowy renaturuje (ze względu na swoją kolistą budowę), zaś DNA genomowy cały czas pozostaje w formie zdenaturowanej. Interesujący nas DNA plazmidowy znajduje się w roztworze, zaś DNA genomowy oraz białka i wszelkie inne zanieczyszczenia znajdują się w osadzie, dlatego też należy przeprowadzić wirowanie, aby oddzielić wcześniej wymienione składniki w sposób bardziej dokładny.

W celu dodatkowego oczyszczenia preparatu z białek należy do supernatantu dodać równą objętość mieszaniny chloroform:alkohol izoamylowy (24:1), dzięki czemu zanieczyszczenia białkowe „przechodzą” do warstwy chloroformowej. Interesuje nas górna warstwa, którą przenosimy do nowej probówki. Takie oczyszczanie możemy przeprowadzić kilka razy. Pobrany przez nas roztwór musi być klarowny, w przeciwnym wypadku prawdopodobnie naruszyliśmy dolną warstwę i zanieczyściliśmy supernatant.

W ten sposób otrzymujemy oczyszczony DNA plazmidowy, który precypitujemy w 96% etanolu, następnie usuwamy supernatant, osad przepłukujemy 70% etanolem, usuwamy go, suszymy i zawieszamy w roztworze TE (Tris+EDTA).

W celu sprawdzenia skuteczności przeprowadzonej przez nas izolacji plazmidowego DNA przeprowadza się elektroforezę otrzymanego preparatu. Wykorzystuje się fakt, iż DNA jest naładowane ujemnie i z tego względu posiada zdolność do migrowania w polu elektrycznym do elektrody dodatniej.

Poniższe zdjęcie przedstawia elektroforetyczny rozdział wyizolowanych plazmidów w sposób właściwy. W kolumnie 2 znajduje się marker wielkości.

Aby sprawdzić, czy przeprowadziliśmy izolację DNA w sposób właściwy, można także wykorzystać zdolność kwasów nukleinowych do selektywnego absorbowania światła UV (nadfioletowego). Maksimum absorpcji przypada na 260nm (A₂₆₀). Dzieje się tak ze względu na występowanie w DNA sprzężonych wiązań podwójnych występujących w układzie purynowym i pirymidynowym.

Maksimum absorpcji mogących zanieczyszczać preparat białek przypada na 280nm (A₂₈₀).

Z tego względu obliczamy stosunek A₂₆₀/ A₂₈₀, aby określić czystość otrzymanego preparatu.

Oto możliwe wyniki:

Wartość A₂₆₀/ A₂₈₀=1,8 oznacza czyste DNA

Wartość A₂₆₀/ A₂₈₀=2 oznacza czyste RNA

Preparat DNA, który mógł zostać zanieczyszczony RNA osiąga wynik A₂₆₀/ A₂₈₀ większy niż 1,8

Czyste białka osiągają wynik A₂₆₀/ A₂₈₀ mniejszy niż 1

Preparat DNA, który mógł zostać zanieczyszczony białkami osiąga wynik A₂₆₀/ A₂₈₀ mniejszy niż 1,8




Serdeczne podziękowania dla doktora Tomasza Kowalczyka za udostępnienie zdjęcia rozdziału elektroforetycznego plazmidów.