Biotechnologia.pl
łączymy wszystkie strony biobiznesu
Detekcja rapamycyny po przeszczepie nigdy nie była tak prosta!
Detekcja rapamycyny po przeszczepie nigdy nie była tak prosta!
Grupa naukowców z Tokyo Institute of Technology opracowała funkcjonalny fluorescencyjny biosensor do detekcji rapamycyny. Wykorzystuje on naturalny cel molekularny tego leku oraz zjawisko fotoindukowanego przeniesienia elektronu (PET). Monitorowanie poziomu rapamycyny stanowi istotny problem badawczy w aspekcie kontroli zapobiegania odrzutom potransplantacyjnym.

Na Wyspie Wielkanocnej....

W roku 1975 wyizolowano po raz pierwszy antybiotyk - rapamycynę.  Źródłem tego makrolidu były bakterie Streptomyces hygroscopicus bytujące w glebie na Wyspie Wielkanocnej. Rapamycyna jest lekiem immunosupresyjnym, stosowanym obecnie po transplantacji nerek. Wiele badań wskazuje ponadto na zdolność tego związku do przedłużania życia oraz na jego aktywność przeciwnowotworową.

Efekty biologiczne wywołane przez rapamycynę spowodowane są jej wiązaniem do cytozolowego białka FKBP12 (ang. FK506 binding protein). Kompleks FKBP12-rapamycyna wiąże się z kolei z domeną w obrębie kinazy mTOR, zwanej FRB. Prowadzi to do inaktywacji enzymu, który  jest serynowo-treoninową kinazą modulującą ścieżki sygnałowe biorące udział w regulacji procesów wzrostu i podziałów komórkowych. Zahamowanie kinazy mTOR (ang. mammalian target of rapamycin kinase) prowadzi również do hamowania aktywności limfocytów T i odczynów immunologicznych.

Bioczujnik prawdę Ci powie...

Monitorowanie poziomu rapamycyny aplikowanej po operacjach przeszczepienia narządów stanowi obecnie istotne wyzwanie, a stosowane w ostatnich latach metody detekcji podlegają szybkiemu rozwojowi. Grupa japońskich naukowców opracowała innowacyjny, prosty sposób fluorescencyjnej detekcji szerokiej grupy antygenów (peptydy, hapteny, większe białka), zwany Q-body (Quenchbody). Metoda ta nie wymaga stosowania dodatkowych reagentów, co stanowi duże udogodnienie. Biosensor Q-body powstaje poprzez przyłączenie „uwięzionego” organicznego fluoroforu do N-końcowego regionu fragmentu przeciwciała.

Poprzez „uwięzienie” rozumie się fakt, że fluorescencja przyłączonego składnika jest wygaszona z uwagi na zjawisko fotoindukowanego przeniesienia elektronu (ang. photoinduced energy transfer, PET) z reszty tryptofanu znajdującego się w obrębie regionu zmiennego przeciwciała (FV). Przyłączenie antygenu indukuje strukturalne zmiany w FV, co z kolei prowadzi do „uwalniania” emisji fluorescencji przyłączonego fluoroforu.

Współautor badań, prof. Hiroshi Ueda z Tokyo Institute of Technology w komentarzu udzielonym  biotechnologia.pl zwraca uwagę: – Zależne od rapamycyny wiązanie FKBP12 i FRB wiernie odzwierciedla zależną od antygenu heterodimeryzację VH i VL, czyli dwóch typów domen budujących przeciwciała.

Fakt ten zainspirował badaczy do stworzenia czujnika poziomu rapamycyny naśladującego koncepcję metody Q-body, czyli zasadę „wygaszanie-uwalnianie”.  Wyniki doświadczeń  zostały ostatnio przedstawione w pracy pt. „A signal-on fluorosensor based on quench-release principle for sensitive detection of antibiotic rapamycin” w czasopiśmie „Biosensors”. W badaniach stosowano trzy typy barwników fluorescencyjnych: ATTO520, TAMRA i ATTO590, przy czym najbardziej obiecujące rezultaty otrzymano w przypadku inkorporacji ATTO520.

Dlaczego przedstawiona metoda detekcji jest bardziej funkcjonalna od stosowanych dotychczas metod? – Podobnie do metody Q-body wykorzystującej przeciwciała, model Q-body do detekcji rapamycyny może być zastosowany w łatwy sposób, po prostu poprzez zmieszanie z próbką biologiczną i pomiar fluorescencji. Czas jaki jest w tym przypadku potrzebny, to najwyżej kilka minut, co jest znacznym udogodnieniem w porównaniu ze stosowanymi dotychczas technikami. Co więcej, czułość metody jest wystarczająca do zastosowania jej w przypadku próbek krwi pacjentów  – mówi prof. Hiroshi Ueda.

Plany, plany...

Jak zapewnia naukowiec, to nie koniec eksperymentów.  Nowa metoda zostanie wkrótce wykorzystana w badaniu dystrybucji rapamycyny in situ lub in vivo. Badacze mają ponadto nadzieję zastosować podobną technikę w oznaczaniu stężenia innych leków, poprzez wykorzystanie specyficznych białek wykazujących zdolność ich wiązania. Decydująca jest jednak obecność reszt tryptofanu w pobliżu miejsca wiązania liganda. Ta cecha pozwala na stworzenie swoistego sensora fluorescencyjnego, w którym fluorofor pełni funkcję układu sygnałowego, natomiast tryptofan stanowi układ receptorowy.

Źródła

Jeong HJ et al. A Signal-On Fluorosensor Based on Quench-Release Principle for Sensitive Detection of Antibiotic Rapamycin. Biosensors 2015, 5(2), 131-140

 

Culzoni MJ et al. Rhodamine and BODIPY chemodosimeters and chemosensors for the detection of Hg2+, based on fluorescence enhancement effects. Anal. Methods, 2013,5, 30-49

 

http://www.molbio.unige.ch/eng/research_groups/loewith/objectifs

KOMENTARZE
Newsletter