Cząsteczki uczestniczące w procesie interferencji RNA można podzielić na kwasy nukleinowe oraz białka. Do grupy pierwszej należą dwuniciowe cząsteczki RNA, które dzieli się na wytwarzane przez komórkę miRNA (microRNA) oraz pochodzące z poza komórki siRNA (short interfering RNA) i długie dsRNA (dublestranded RNA). Wśród białek uczestniczących w tym procesie należy wymienić białko Dicer tnące długie cząsteczki RNA na cząsteczki siRNA, kompleks RISC (RNA induced silencing complex) oraz niezwiązane bezpośrednio z procesem rybonukleazy degradujące pocięte mRNA.
Naturalnie występujące cząsteczki RNA odpowiedzialne za regulację genów to miRNA, występują one zarówno u roślin jak i zwierząt w tym u człowieka[1]. Pierwotny transkrypt to jednoniciowe RNA, w którego strukturze drugorzędowej występuje wiele fragmentów „spinki do włosów”, zazwyczaj każdy taki fragment to jedna cząsteczka miRNA. W wyniku działania tych RNA dochodzi do zahamowania translacji[2] lub degradacji docelowego mRNA[3,4,5]. Podział między zwierzętami i roślinami na dominujący mechanizm wskazuje na to, że o mechanizmie wyciszenia decyduje stopień komplementarności miRNA z docelowym mRNA. U zwierząt, u których występuje niższy stopień komplementarności pomiędzy miRNA i docelowym mRNA[6], miRNA powoduje zahamowanie translacji, a u roślin przeważa degradacja mRNA[3,4,7], chociaż u tych organizmów może również zachodzić hamowanie translacji[8].
siRNA
Cząsteczka RNA, która ma wywołać wyciszenie genu może być wprowadzona do komórki na kilka sposobów. Poprzez transfekcję komórek dsRNA, siRNA lub w postaci plazmidu. W ostatnim przypadku cząsteczka RNA przed związaniem z białkiem Dicer ma strukturę spinki do włosów (shRNA - short hairpin RNA).
siRNA powstaje podczas cięcia długiego dwuniciowego RNA (dsRNA) na fragmenty 21-23-nukleotydowe przez białko Dicer. Proces ten jest zależny od ATP[9]. Cząsteczka siRNA składa się z dwóch komplementarnych nici: sensownej i antysensownej. Nić antysensowna jest komplementarna do odpowiedniego fragmentu nici docelowego mRNA. Sekwencja nici sensownej jest taka sama jak sekwencja docelowego mRNA. Każda cząsteczka siRNA charakteryzuje się występowaniem na końcu 3’ obu nici dwóch dodatkowych nukleotydów oraz występowaniem reszty kwasu fosforowego na końcu 5’ a grupy hydroksylowej na końcu 3’[10]. Tylko jedna nić odpowiada za aktywność siRNA i pozostaje związana z kompleksem RISC, siRNA powinno charakteryzować się zróżnicowaną w obrębie cząsteczki stabilnością termodynamiczną. Występujące na końcu 5’ nici antysensowej błędy w sparowaniu zasad lub obecność adenozyny powodują niską stabilność tego regionu i właśnie ta nić jest wiązana z RISC[11,12,13,14]. Dużą stabilność powinien wykazywać koniec 5’ nici sensownej, co zapobiegnie związaniu tej nici z kompleksem RISC. Występowanie uracylu w pozycji 10 nici sensownej wspomaga cięcie mRNA przez kompleks RISC-nić antysensowna[14]. Podsumowując cząsteczka siRNA składa się z 19-nukleotydowego odcinka dwuniciowego i dwóch dodatkowych nukleotydów, najczęściej 2-deoksy-tymin, na każdym końcu 3’. Powinna się ona charakteryzować zróżnicowaniem w stabilności termodynamicznej pomiędzy jej reginami tak, aby ułatwić rozplecenie i związanie się odpowiedniej nici z białkami odpowiedzialnymi za cięcie mRNA.
Dicer
RNazyIII dzielą się na trzy klasy. Wszystkie enzymy należące do tych trzech klas składają się co najmniej z domeny RNazyIII i domeny wiążącej dwuniciowe RNA. Klasa pierwsza występuje u bakterii i drożdży, klasa druga to, np.: Drosha u muszki owocowej, a trzecia to, np.: Dicer u człowieka i muszki owocowej. Dla klasy trzeciej tych RNaz cechą charakterystyczną jest domena PAZ. Dicer należący do klasy trzeciej RNazIII składa się z domeny o aktywności helikazy, domeny o nieznanej funkcji DUF283, domeny PAZ, dwóch domen o aktywności endonukleazy (RNaseIII) oraz domeny wiążącej dwuniciowe RNA (dsRBD)[15]. Domena PAZ składa się ze 110 aminokwasów i rozpoznaje końce 3’ dsRNA z dwoma dodatkowymi niesparowanymi nukleotydami, wiążąc się z tym końcem[16,17]. Rozpoznanie końca 3’ odbywa się na zasadzie dopasowania przestrzennego. Dwie domeny mają aktywność katalityczną RNaseIII i odpowiadają za cięcie nici RNA. Każda z tych dwóch domen posiada jedno centrum aktywne, więc jest zdolna do wykonania tylko pojedynczego cięcia[18]. Domena dsRBD pozwala na przyłączenie się enzymu do dsRNA nieposiadającego dodatkowych nukleotydów na końcu 3’. Domena ta tym samym jest niezbędna dla rozpoczęcia procesu wyciszania genów, gdyż pozwala na wykonanie pierwszego cięcia dsRNA, które jeszcze nie posiada na swych końcach 3’ dodatkowych nukleotydów[18]. Rola i miejsce wiązania domeny o aktywności helikazy nie zostały jeszcze poznane. Zaraz po potwierdzeniu udziału tego enzymu w szlaku siRNA pojawiły się doniesienia o udziale Dicer w dojrzewaniu miRNA[19,20,21,22], a w konsekwencji, że odgrywa ważną rolę w rozwoju organizmu. Udział w szlaku działania miRNA został potwierdzony w eksperymentach na myszach. Zahamowanie aktywności enzymu było letalne już we wczesnych etapach rozwoju embrionalnego[23]. Genomy ludzki i C. elegans kodują tylko jedno białko Dicer, które oddziałuje zarówno z siRNA, jak i z miRNA. U muszki owocowej występują dwa takie białka: Dcr-1 uczestniczące w szlaku miRNA oraz Dcr-2 uczestniczące w szlaku siRNA. U Arabidopsis odnaleziono cztery enzymy tej grupy i tu także sugeruje się podział ich funkcji. Finnegan i wsp[24]. wykazali, że mutacja jednego z nich – DCL1 (białka homologicznego do Drc-1 u Drosophila) zaburza szlak miRNA ale nie wpływa na szlak siRNA.
RISC
Indukowany RNA kompleks wyciszający (RISC) jest to kompleks białek, z których najważniejszym jest członek rodziny Argonaute białko Argonaute2 (Ago2)[25]. Zidentyfikowano także inne białka tworzące RISC: VIG – białko wiążące RNA, dFXR – występujący u muszki owocowej homolog białka Fragile X, białka o aktywności helikaz i białko Tudor-SN.Rola tych białek w procesie RNAi nie została jeszcze całkowicie wyjaśniona. Rodzina Argonaute to grupa białek konserwatywnych występująca u większości organizmów eukariotycznych i części prokariotycznych. Białka te składają się z domen: N-terminalnej, PAZ, domeny środkowej podobnej do Lac-Z oraz z domeny PIWI. Ostatnia wymieniona ma aktywność katalityczną RNazy H[26]. Podobnie jak RNaza H domena PIWI do swojej aktywności katalitycznej wymaga dwuwartościowego metalu[27]. U człowieka zidentyfikowano cztery białka wchodzące w skład rodziny Argonaute nazwane odpowiednio Ago1-4. Wszystkie te białka tak samo wiążą się z siRNA i miRNA, ale tylko Ago2 zostało znalezione w kompleksie RISC i tylko to białko daje możliwość wyciszenia genu za pomocą siRNA lub miRNA[28,29]. Wykazano, że do wyciszenia genu wystarczy użyć tylko dwóch składników: omawianego białka Ago2 i siRNA o odpowiedniej sekwencji[30].
Bibliografia:
1. Bartel, David P. 2004, MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell; 116, 281-297.
2. Wienholds, Erno oraz Plasterk, Ronald H. A. 2005, MicroRNA function in animal development. FEBS Letters; 579, 5911-5922.
3. Llave, C., Xie, Z., Kasschau, K., oraz Carrington, J. 2002, Cleavage of Scarecrow-like mRNA targets directed by a class of Arabidopsis miRNA. Science; 297, 2053-2056.
4. Kasschau, K., Xie, Z., Allen, E., Llave, C., Chapman, E., Krizan, K., oraz Carrington, J. 2003, P1/HC-Pro, a viral suppressor of RNA silencing, interferes with Arabidopsis development and miRNA function. Dev.Cell; 4, 205-217.
5. Boutet, S., Vasquez, F., Liu, J., Béclin, C., Fagard, M., Gratias, A., Morel, J. B., Crete, Patrice, Chen, X., oraz Vaucheret, Herve 2003, Arabidopsis HEN1: a genetic link between endogenous miRNA controlling development and siRNA controlling transgene silencing and virus resistance. Current Biology; 13, 843-848.
6. Ambros, V. 2004, The functions of animal microRNAs. Nature; 431, 350-355.
7. Tang, G., Reinhart, B., Bartel, David P., oraz Zamore, Phillip D. 2003, A biochemical framework for RNA silencing in plants. Genes and Development; 17, 49-63.
8. Chen, X. 2004, A microRNA as a translational repressor of APETALA2 in Arabidopsis flower development. Science; 303, 2022-2025.
9. Zamore, Phillip D., Tuschl, Thomas, Sharp, Phillip A., oraz Bartel, David P. 3-31-2000, RNAi: Double-Stranded RNA Directs the ATP-Dependent Cleavage of mRNA at 21 to 23 Nucleotide Intervals. Cell; 101, 25-33.
10. Elbashir, Sayda M., Lendeckel, Winfried, oraz Tuschl, Thomas 2001, RNA interference is mediated by 21- and 22-nucleotide RNAs. Genes and Development; 15, 188-200.
11. Khvorova, A., Reynolds, A., oraz Jayasena, S. D. 2003, Functional siRNAs and miRNAs exhibit strand bias. Cell; 115, 209-216.
12. Reynolds, A., Leake, D., Boese, Q., Scaringe, S., Marshall, W. S., oraz Khvorova, A. 2004, Rational siRNA design for RNA interference. Nature Biotechnology; 22, 326-330.
13. Ui-Tei, K., Naito, Y., Takahashi, F., Haraguchi, T., Ohki-Hamazaki, H., Juni, A., Ueda, R., oraz Saigo, K. 2004, Guidelines for the selection of highly effective siRNA sequences for mammalian and chick RNA interference. Nucleic Acids Research; 32, 936-948.
14. Mittal, V. 2004, Improving the efficiency of RNA interference in mammals. Nat.Rev.Genet.; 5, 5: 355-365.
15. Carmell, M. A. oraz Hannon, Gregory J. 2004, RNase III enzymes and the initiation of gene silencing. Nat.Struct.Mol.Biol.; 11, 214-218.
16. Song, J. J., Liu, J., Tolia, N. H., Schneiderman, J., Smith, S. K., Martienssen, R. A., Hannon, Gregory J., oraz Joshua-Tor, L. 2003, The crystal structure of the Argonaute2 PAZ domain reveals an RNA binding motif in RNAi effector complexes. Nat.Struct.Biol.; 10, 1026-1032.
17. Yan, K. S., Yan, S., Farooq, A., Han, A., Zeng, L., oraz Zhou, M. 2003, Structure and conserved RNA binding of the PAZ domain. Nature; 426, 468-474.
18. Zhang, H., Kolb, F. A., Jaskiewicz, L., Westhof, E., oraz Filipowicz, W. 2004, Single processing center models for human Dicer and bacterial RNase III. Cell; 118, 57-58.
19. Hutvagner, G., McLachlan, J., Pasquinelli, A. E., Balint, E., Tuschl, Thomas, oraz Zamore, Phillip D. 2001, A cellular function for the RNA-interference enzyme Dicer in the maturation of the let-7 small temporal RNA. Science; 293, 834-838.
20. Grishok, Alla 2001, Genes and mechanisms related to RNA interference regulate expression of the small temporal RNAs that control C. elegans developmental timing. Cell; 106, 23-34.
21. Knight, S. W. oraz Bass, Brenda L. 2001, A role for the RNase III enzyme DCR-1 in RNA interference and germ line development in Caenorhabditis elegans. Science; 293, 2269-2271.
22. Ketting, Rene F., Fischer, Sylvia E. J., Bernstein, Emily, Sijen, Titia, Hannon, Gregory J., oraz Plasterk, Ronald H. A. 2001, Dicer functions in RNA interference and in synthesis of small RNA involved in developmental timing in C. elegans. Genes and Development; 15, 2654-2659.
23. Bernstein, Emily 2003, Dicer is essential for mouse development. Nature Genetics; 35, 215-217.
24. Finnegan, Jean, Margis, R., oraz Waterhouse, P. M. 2003, Current Biology; 13, 236-240.
25. Hammond, S. M., Boettcher, S., Caudy, A. A., Kobayashi, R., oraz Hannon, Gregory J. 2001, Argonaute2, a link between genetic and biochemical analyses of RNAi. Science; 293, 1146-1150.
26. Song, J. J., Smith, S. K., Hannon, Gregory J., oraz Joshua-Tor, L. 2004, Crystal structure of Argonaute and its implications for RISC slicer activity. Science; 305, 1434-1437.
27. Keck, J. L., Goedken, E. R., oraz Marqusee, S. 1998, Activation/ attenuation model for RNase H. A one-metal mechanism with second-metal inhibition. The Journal of Biological Chemistry; 273, 34128-34133.
28. Meister, G., Landthaler, M., Patkaniowska, A., Dorsett, Y., Teng, G., oraz Tuschl, Thomas 2004, Human Argonaute2 mediates RNA cleavage targeted by miRNAs and siRNAs. Molecular Cell; 15, 185-197.
29. Liu, J. 2004, Argonaute2 is the catalytic engine of mammalian RNAi. Science; 305, 1437-1441.
30. Rivas, F. V., Tolia, N. H., Song, J. J., Aragon, J. P., Liu, J., Hannon, Gregory J., oraz Joshua-Tor, L. 2005, Purified Argonaute2 and an siRNA form recombinant human RISC. Nat.Struct.Mol.Biol.; 12, 340-349.
KOMENTARZE