Sekwencjonowanie RNA nowej generacji (RNA-seq) oraz mikromacierze ekspresyjne to obecnie najczęściej stosowane techniki globalnej analizy transkryptomu i identyfikacji genów odmiennie ekporymowanych w danych warunkach doświadczalnych. Jednak to, co może uniemożliwiać ich zastosowanie, szczególnie w małych grantach, to specyficzne wymagania sprzętowe i programowe (niezbędne zarówno do wykonania jak i analizy wyników) oraz wciąż relatywnie wysoki koszt. W pierwszej części artykułu, jako alternatywę, przedstawiliśmy bakteryjne systemy reporterowe. Tą metodą możemy uzyskać informacje o genach bakteryjnych ulegających nadekspresji w danych warunkach doświadczalnych. Technika ta, choć pracochłonna, możliwa jest do wykonania w każdym laboratorium biologii molekularnej oraz pozwala uzyskać stałą kolekcję mutantów. Druga z prezentowanych metod może być zastosowana zarówno do badań komórek eukariotycznych jak i prokariotycznych.
 

Komórki eukariotyczne

Historia techniki DDRT-PCR (ang. Differential Display Reverse Transcription PCR) sięga 1992 roku (Liang & Pardee 1992) i polega na amplifikacji komórkowego mRNA. Istotne jest tu zastosowane zestawu starterów, gdzie jeden jest komplementarny do ogona poli(A), natomiast pozostałe są krótkimi (9-10 nt), niespecyficznymi staterami o przypadkowej sekwencji. Ponieważ niespecyficzne startery przyłączają się w różnej odległości od końca poli(A), w efekcie odwrotnej transkrypcji i amplifikacji powstają fragmenty cDNA różnej długości (ok. 200-1000 pz), które następnie można wizualizować w żelu poliakrylamidowym lub agarozowym o wysokiej rozdzielczości. Stosując jednakowy zestaw starterów do amplifikacji mRNA badanych prób doświadczalnych porównuje się wzory uzyskanych prążków, które w zależności od różnic w ekspresji ujawnią zróżnicowaną intensywność, obecność lub brak danych prążków. Zastosowanie jednakowego zestawu starterów i warunków amplifikacji zapewnia powtarzalność metody. Specyficzne prążki charakterystyczne dla danych warunków izoluje się z żelu, reamplifikuje i sekwencjonuje, identyfikując geny ulegające obniżonej lub podwyższonej ekspresji.

Ref. Sharma S. et al. 2004

Komórki prokariotyczne

Brak poliadenylacji mRNA w komórkach prokariotycznych uniemożliwia zastosowanie wyżej opisanej metody w jej klasycznej postaci. W tym przypadku znajduje zastosowanie zmodyfikowana technika, której oryginalna nazwa angielska to RNA fingerprinting of arbitrarily primed PCR (RAP-PCR), zaś próba jej polskiego tłumaczenia przyprawia o zawrót głowy… Modyfikacja polega na zastosowaniu zestawu krótkich, niespecyficznych starterów, które przyłączają się w sposób przypadkowy do całkowitego RNA komórkowego, zarówno na etapie odwrotnej transkrypcji jak i reakcji wydłużania w syntezie drugiej nici cDNA. W zależności od ilości stosowanych starterów (od kilku do kilkuset) pokrycie genomu może istotnie wzrastać. Przykładowy protokół wykorzystania RAP-PCR w analizie transkryptomicznej bakterii Gram-dodatnich opublikowano w 2001 roku (Walters et al. 2001). Wykorzystano w nim zestaw 250 starterów o sekwencji 5’-CGGAGCAGATCGVWXYZ-3’, gdzie VWXYZ to kombinacja zasad A, G i C, zaś sekwencja powtarzająca się została zaprojektowana tak, by zminimalizować przyłączanie do trwałych form RNA (np. sekwencji 16S i 23S rRNA). W pierwszej rundzie odwrotnej transkrypcji dochodzi do przypadkowej syntezy fragmentów pierwszej nici cDNA. W drugiej rundzie (syntezie drugiej nici) wydłużanie starterów także zachodzi w niskiej temperaturze, co zwiększa przypadkowość amplifikacji. W kolejnych rundach amplifikacja zachodzi w standardowych warunkach reakcji PCR. Podobnie jak w standardowej metodzie DDRT-PCT, rozdział fragmentów DNA umożliwia identyfikację specyficznych prążków różniących się pomiędzy badanymi próbkami. Prążki te następnie izoluje się z żelu, klonuje do odpowiedniego wektora, reamplifikuje i sekwencjonuje. Relatywnie wysokie pokrycie genomu przy zastosowaniu dużej ilości starterów pozwala na składanie zidentyfikowanych fragmentów sekwencji w kontigi i dokładną identyfikację genów lub całych operonów ulegających odmiennej ekspresji. Przy zastosowaniu jednakowego zestawu starterów i warunków amplifikacji, metoda ta zapewnia odpowiednią powtarzalność.

       

Ponieważ mRNA bakteryjne jest policistronowe, identyfikacja choćby jednego lub kilku genów z danego operonu ułatwia identyfikację całych szlaków metabolicznych zaangażowanych w badaną odpowiedź komórkową. Należy jednak brać pod uwagę, że analizowany jest całkowity RNA bakteryjny i mimo doboru specjalnej sekwencji początkowej starterów, 10-20% prążków wciąż stanowią fragmenty 16S i 23S rRNA.

Podsumowując opisane techniki, metoda RNA fingerprinting oparta o DD-PCR i RAP-PCR pozwala na identyfikację genów ulegającyh zarówno obniżonej, jak i podwyższonej ekspresji w porównaniu do warunków kontrolnych, co stanowi jej zaletę w porównaniu do opisanych w części pierwszej systematów reporterowych.
 

Zalety:

• możliwość wykonania przy pomocy standardowych technik biologii molekularnej
• niższy koszt niż w przypadku zautomatyzowanych metod wysokoprzepustowych
• możliwość identyfikacji genów ulegających zarówno obniżonej, jak i podwyższonej ekspresji

Wady:

• czaso- i pracochłonność
• niecałkowite pokrycie genomu

Przykładowa literatura:

• Liang P, Pardee AB.Differential display of eukaryotic messenger RNA by means of the polymerase chain reaction. Science. 1992 Aug 14;257(5072):967-71.
• Walters DM, Russ R, Knackmuss HJ, Rouvière PE. High-density sampling of a bacterial operon using mRNA differential display. Gene. 2001 Aug 8;273(2):305-15.