Charakterystyka faga P1

P1 jest fagiem ogonkowym należącym do rodziny Myoviridae. Infekuje Escherichia coli i wiele innych enterobakterii. Jest  utrzymywany w lizogenach jako stabilny niskokopiowy plazmid. Obok bakteriofaga T4 i λ należy do fagów najlepiej poznanych pod względem biologii molekularnej. Opisano jego strategie namnażania się oraz pełną sekwencję genomu.

Enzymy lityczne bakteriofagów

Rozpad bakteryjnych osłon komórkowych w procesie uwalniania dojrzałych fagów zachodzi pod wpływem fagowych enzymów litycznych. Proces ten u fagów ogonkowych jest uzależniony od obecności dwóch białek: holiny i endolizyny, kodowanych typowo przez geny jednego operonu. Endolizyna  trawi peptydoglikan ściany komórkowej. Zaś holina tworząc pory w błonie komórkowej, oddzielającej ścianę komórkowa od cytoplazmy, zapewnia endolizynie dostęp do jej substratu. System holina-endolizyna, w którym do eksportu endolizyny z cytoplazmy do peryplazmy wymagane jest białko pomocnicze, przez długi czas uznawany był za uniwersalny mechanizm regulujący lizę bakteryjną. Jest jednak kilka przykładów lizyn, w tym właśnie endolizyna faga P1, które  wyposażone są na  N-końcu w tzw. sekwencję dokującą,   SAR (od ang. signal arrest domain).  Początkowo nieaktywny enzym zostaje z udziałem sekwencji SAR  uwięziony w membranie podczas gdy jego część katalityczna jest już obecna w peryplazmie. Dopiero spontaniczna bądź indukowana depolaryzacja błony doprowadza do ostatecznego uwolnienia enzymu i przekształcenia go w aktywną formę.

Nietypowy układ genów litycznych faga P1

Struktura i organizacja genów kodujących funkcje lityczne faga P1 w porównaniu z innym wirusami tego typu jest jednak bardzo nietypowa. Geny te zorganizowane są bowiem w aż trzech operonach. Gen lyz koduje jedyną jak dotąd zidentyfikowaną endolizynę tego faga. Posiada ona na N-końcu domenę SAR. Poza tym w genomie faga P1 zlokalizowano aż trzy geny kodujące funkcje holin. I tylko jeden z nich – gen lydD jest transkrybowany wspólnie z lyz, natomiast dwa pozostałe lydA i lydC zlokalizowane są w niesprzężonych z lyz operonach. I tak jednogenowy operon lydC poprzedza gen lydA kolejnego już wielogenowego operonu (dar). Taki skomplikowany układ sekwencji kodujących enzymy lityczne bardzo dziwi naukowców. Bakteriofagi jako wirusy o niewielkich rozmiarach powinny jak najefektywniej wykorzystywać swój genom. Dlatego naukowcy coraz częściej zadają sobie pytanie, jaki jest cel kodowania aż trzech białek o funkcjach holin. Zarówno rola poszczególnych białek litycznych faga P1, jak i samej domeny SAR obecnej w endolizynie pozostawia wciąż wiele niejasności.

Stan badań naukowych dotyczących funkcji holin w rozwoju litycznym faga P1 – opowiada dr hab. Małgorzta Łobocka, prof. nadzw. IBB PAN

Do wywołania lizy zainfekowanej komórki bakteryjnej konieczna jest zazwyczaj funkcjonalna endolizyna oraz  białko pomocnicze — holina. Weryfikacja  funkcji litycznych każdego z tych białek wymaga więc sklonowania kodujących je genów w plazmidach ekspresyjnych i sprawdzenia czy indukcja ekspresji obu genów na raz w komórce spowoduje jej lizę. Liza jest widoczna jako przejaśnienie hodowli bakterii, a jej tempo można łatwo oznaczać mierząc zmiany gęstości optycznej hodowli w czasie. Dodatkowo, oczekujemy, że inaktywacja w genomie faga (tzw. knock-out) konkretnego genu kodującego funkcje lityczne spowoduje jakiś defekt lizy, np.: opóźnienie lizy lub jej całkowity brak. Między innymi,  tymi właśnie metodami posługujemy się na co dzień w naszych badaniach. Organizacja genu lyz  w jedną jednostkę transkrypcyjną z genem lydD, kodującym białko o motywach  sekwencji aminokwasowej charakterystycznych dla holin sugerowała, ze lyz i lydD mogą razem pełnić funkcje kasety litycznej. Hipotezę takę potwierdziliśmy poprzez wykazanie  że indukcja ekspresji w komórkach E. coli genów lyz i lydD, sklonowanych w plazmidzie,  powoduje lizę komórek. Produkt genu lydD okazał się współdziałać z produktem genu lyz. Brak lydD w plazmidzie powodował opóźnienie lizy. Współdziałanie LydD z heterologiczną endolizyną R faga λ, która nie zawiera domeny SAR i bezwzględnie wymaga do wywołania lizy białek pomocniczych, ostatecznie potwierdziło aktywność LydD jako holiny.  Pojawiło się więc pytanie o rolę  dwóch innych białek faga P1 o strukturze holin (LydA i LydC) w lizie komórek bakterii podczas uwalniania namnożonych fagów. Inaktywując geny kodujące te białka w genomie faga wykazaliśmy, że brak produktu każdego z nich skutkuje zaburzeniami lizy, przy czym brak LydA całkowicie hamował lizę, wskazując na niezbędność tej holiny w rozwoju litycznym faga. W nieobecności LydA  endolizyna prawdopodobnie nie jest zdolna dotrzeć do peptydoglinanu sciany komórkowej. Zastąpienie funkcji LydA chloroformem – rozpuszczalnikiem organicznym niszczącym błony komórkowej, przywracało zdolność mutanta lydA do lizy.   Rola produktu genu lydC w lizie nie jest jasna. Znajduje się on w jednogenowym operonie bezpośrednio przed regionem promotorowym genu lydA – pierwszego genu wielogenowego operonu. Co ciekawe, pomiędzy genami tych operonów nie ma żadnego terminatora. Ekspresja genu lydC podczas rozwoju litycznego faga P1 może być jednak ograniczona działaniem  ρ-niezależnego terminatora, znajdującego się bezpośrednio przed sekwencją kodującą genu lydC. Może on powodować przedwczesną terminację transkrypcji  genu lydC, a w konsekwencji dominację transkrypcji lydA. Być może rodzaj bakteryjnego gospodarza faga P1 lub warunki wzrostu bakterii moduluja poziom ekspresji lydC w stosunku do lydA, czyniąc lizę zależną od produktu jednego bądź drugiego z tych genów.

Podsumowanie

Wyniki dotychczas uzyskane w ramach owocnej współpracy prowadzonej między IBB PAN i SGGW w Warszawie jak do tej pory nie dały jednoznacznej odpowiedzi na pytanie o sens występowania aż trzech genów kodujących holiny w genomie faga P1, podczas gdy obecność już tylko jednego z nich umożliwia rozpad komórek. Jednak prawdopodobnie aktywność tych trzech genów wzmaga cały proces lityczny i reguluje czas lizy. Również obecność  domeny SAR w końcowej części białka Lyz bakteriofaga P1 nie znajduje dotąd wytłumaczenia. Wyniki bowiem sugerują, że jej fizjologiczną rolą nie jest uniezależnienie się enzymu od obecności holin, co zazwyczaj przypisuje się funkcji takich domen. Badania mające na celu identyfikację możliwego przeznaczenia tej domeny poprzez porównanie fenotypu faga dzikiego i mutanta o nieaktywnej domenie SAR są prowadzone.

Artykuł powstał na podstawie wyników pracy zespołu w składzie:  Wioleta Woźnica, Joanna Nasierowska, Agata Cena, Sylwia Radomska, Xiu Juan Li, Urszula Gągała i Małgorzata Łobocka pezentowanych przez mgr Wiolettę Woźnicę na IV Kongresie Genetyki w Poznaniu w wystąpieniu pt. ,,Analiza funkcjonalna genów litycznych bakteriofaga P1”. Za skomentowanie jego treści dziękujemy dr hab. Małgorzcie Łobockiej, a pracownikom Zakładu Biochemii Drobnoustrojów IBB PAN w Warszawie oraz Samodzielnego Zakładu Biologii Mikroorganizmów, Wydziału Rolnictwa i Biologii SGGW, życzymy wszelkiej pomyślności i dalszych sukcesów naukowych.

dr Marzena Szwed, redaktor naukowy portalu Biotechnologia.pl