Receptory dopaminowe należą do rodziny białek zależnych od białek G (GPCRs). Wspólną cechą GPCRs jest obecność 7 przecinających błonę komórkową odcinków alfa-helikalnych. W odpowiedzi na wiązanie specyficznych ligandów (neurotransmitery, hormony, cytokiny, substancje zapachowe, indukcja światłem), GPCRs ulegają zmianom konformacyjnym, które pozwalają następnie na ich oddziaływanie z białkami G i w konsekwencji, przeniesienie sygnału na enzym efektorowy.

Do realizacji większości funkcji dopaminy niezbędna jest równoczesna stymulacja receptorów D1 i D2. Zjawisko to nosi nazwę synergizmu obligatoryjnego i polega na tym, że agoniści receptorów D1 i D2 nie tylko potęgują wzajemnie swoje działanie, ale każdy z nich jest nieskuteczny wówczas, gdy jest zastosowany w obecności antagonisty drugiego typu receptora.

Celem prowadzonego projektu jest weryfikacja zaproponowanego przez nas modelu kooperatywnego działania receptorów dopaminowych D1 i D2 w błonie komórkowej. Model ten zakłada, że receptory D1 i D2, mające różne powinowactwo do dopaminy, występują w błonie komórkowej w różnych sub-stanach konformacyjnych a wiązanie ligandów, takich ja dopamina i inni agoniści, wpływa na przesunięcie stanu równowagi receptorów w kierunku aktywnego biologicznie stanu konformacyjnego, który umożliwia ich wzajemne oddziaływanie. Z kolei, oddziaływanie między receptorami D1 i D2 wpływa kooperatywnie na stałe asocjacji dopaminy (i innych ligandów) do receptorów D1 lub D2 a także może wpływać na stałe wiązania białka Gs do receptora D1 oraz białka Gi do receptora D2.

Wybór do badań receptorów dopaminowych D1 i D2 związany jest z ich ważną rolą w funkcjonowaniu mózgu człowieka. Kontrolują one m.in. motorykę i funkcje endokrynologiczne, odgrywają także istotną rolę w regulacji funkcji poznawczych oraz układu nagrody i kary. Zaburzenia w obrębie receptorów dopaminowych mogą prowadzić do wystąpienia symptomów podobnych do choroby Parkinsona, schizofrenii, pląsawicy Huntingtona oraz symptomów obserwowanych w uzależnieniach lekowych. Leki stosowane w terapii schizofrenii, syndromu Tourette'a czy ADHD, są ligandami receptorów dopaminowych, a substancje uzależniające (jak kokaina czy amfetamina) działają poprzez ośrodkowy układ dopaminowy.

Odkrycie zjawiska synergizmu obligatoryjnego receptorów dopaminowych D1/D2 ma duże znaczenie w zrozumieniu mechanizmów etiopatogenezy i terapii tych schorzeń neuropsychiatrycznych, w których dochodzi do zaburzeń transmisji dopaminergicznej w mózgu. Tym bardziej istotne wydaje się zbadanie molekularnych mechanizmów leżących u podstaw tego zjawiska. Poznanie udziału poszczególnych domen czy też reszt aminokwasowych istotnych w interakcji białek receptorowych pozwoli na zaproponowanie molekularnego mechanizmu oddziaływań tych białek błonowych. Badania prowadzone w obecności ligandów (agonistów i antagonistów) receptorów dopaminowych D1 i D2, które są często lekami – mogą się przyczynić do lepszego zrozumienia mechanizmów działania tych leków.

Projekt zakłada przeprowadzenie badań w układzie in vivo (hodowle komórek HEK293 transfekowanych plazmidami zawierającymi geny kodujące receptory dopaminowe D1 i D2) oraz in vitro (frakcje błon z wbudowanymi receptorami i, ewentualnie, duże jednowarstwowe liposomy).

Oddziaływania receptorów D1 i D2 oraz białek G w komórkach mierzone będą przy użyciu metody FRET. Zarówno białka receptorowe, jak białka G zostaną sprzęgnięte z muteinami CFP i YFP. W badaniach wykorzystanych zostanie szereg jednopunktowych mutein białek receptorowych D1 i D2. Dla wszystkich mutein, metodą analizy saturacyjnej wyznaczone zostaną parametry wiązania poszczególnych ligandów.  Do badań dynamiki zmian strukturalnych receptorów D1 i D2 w układzie in vivo planuje się wykorzystanie jednopunktowych mutein zawierających pojedyncze reszty tryptofanowe zlokalizowane w różnych miejscach badanych receptorów, a także receptory z dodatkowymi resztami cysteiny, które pozwolą na specyficzne wyznakowanie badanych receptorów znacznikami fluorescencyjnymi. W badaniach tych wykorzystane zostaną zarówno pomiary FRET, jak i pomiary anizotropii fluorescencji.

na podstawie: http://biotka.mol.uj.edu.pl/zbf/index.php?p=projekt_recepto