Józef Kapusta: Tematyką szczepionek doustnych, a ściślej prototypowych szczepionek opartych na roślinach genetycznie modyfikowanych wytwarzających antygeny mikroorganizmów chorobotwórczych, które mogą być traktowane jako szczepionki podawane na drodze doustnej, zainteresowałem się w połowie lat 90tych ubiegłego wieku. Pragnę w tym kontekście zauważyć jednak, że chronologicznie rzecz ujmując, autorem pomysłu wytwarzania szczepionek w roślinach jest prof. Andrzej Płucienniczak, który pracował wówczas w Centrum Wirusologii i Mikrobiologii PAN w Łodzi oraz kierował Zakładem Inżynierii Genetycznej w firmie farmaceutycznej Terpol w Sieradzu. Na pomysł wytwarzania szczepionek w roślinach Profesor wpadł na początku lat 90tych. Początkowo realizował ten projekt w ramach własnego zespołu w Łodzi i w Sieradzu, a następnie równolegle zaproponował współpracę prof. Andrzejowi Legockiemu z Instytutu Chemii Bioorganicznej PAN w Poznaniu, w którego zespole wówczas pracowałem i zajmowałem się technologią otrzymywania roślin transgenicznych. Profesor Płucienniczak w  roku 1993 przekazał do Instytutu Chemii Bioorganicznej kilka własnej konstrukcji wektorów plazmidowych Agrobacterium tumefaciens do transformacji genetycznej roślin, w tym między innymi plazmid, który zawierał gen kodujący białko otoczki s-HBs, wirusa zapalenia wątroby typu B (HBV). Ze względu jednak, iż jesienią 1993 roku wyjechałem na kontrakt do Stanów Zjednoczonych, tematykę tą podjąłem dopiero po powrocie z USA. 

 

Na początku uzyskaliśmy transgeniczny tytoń i kalus łubinu. Rośliny oraz transgeniczną tkankę łubinu traktowaliśmy jedynie jako nośnik, z którego antygen mógłby być izolowany. Do koncepcji doustnego zaaplikowania rośliny transgenicznej jako szczepionki dochodziłem w miarę jak stawała się oczywista skala przewidywanych trudności, jeśli miałyby być wdrożone badania nad izolacją białka wirusowego z transgenicznych roślin i tkanek charakteryzujących się stosunkowo niskim i nieustabilizowanym poziomem ekspresji. Sygnałem ukierunkowującym moje zainteresowania badawcze na użycie roślin transgenicznych jako nośnika szczepionek podawanych doustnie stanowiła dla mnie nieoczywista wówczas konstatacja, iż tzw. celiakia tj. nietolerancja pokarmowa na gluten, stanowi w istocie silną odpowiedź immunologiczna na to białko, które za wyjątkiem kukurydzy obecne jest w nasionach większości spożywanych zbóż. Z własnych obserwacji rodzinnych dziecka, u którego w niemowlęctwie  wystąpiły przez pewien okres objawy nietolerancji na gluten, wiedziałem, że nawet niewielka, a wręcz śladowa ilość tego białka, jest w stanie sprowokować wznowienie niezwykle silnej odpowiedzi immunologicznej nawet po długim, kilkumiesięcznym okresie „glutenowej abstynencji”.

 

Jednocześnie przypadkowo zapoznałem się z publikacją na temat szczepionki przeciwko wirusowi Polio, która pierwotnie podawana była wyłącznie doustnie. Doustne przyjęcie szczepionki przeciwko Polio, pamiętałem jeszcze z własnego dzieciństwa. Przypomnienie faktu doustnego przyjęcia szczepionki przeciwko Polio, wsparte obserwacjami przebiegu choroby u dziecka oraz informacjami z literatury uzmysławiały, że w przestrzeni błon śluzowych przewodu pokarmowego toczy się subtelna, ale jednocześnie bardzo zdecydowana ‘gra’,  której stawką jest przeżycie w warunkach permanentnego napływu poprzez błony śluzowe różnego rodzaju czynników, w tym także chorobotwórczych. Wiele różnych antygenów dostają się do naszego organizmu wraz z pokarmem, dlatego droga pokarmowa stanowi niewątpliwie najszersze wrota wnikania do naszego organizmu również mikroorganizmów chorobotwórczych. 

 

W połowie lat 90tych podjęliśmy badania na zwierzętach, które polegały na eksperymentalnym szczepieniu na drodze pokarmowej przy użyciu transgenicznego kalusa łubinu. Doświadczenia zainicjowaliśmy  pomimo sceptycyzmu większości rozmówców, którzy logicznie dowodzili, że główną funkcją przewodu pokarmowego jest trawienie przyjmowanego pokarmu. Wynik tych badań był jednakże niezwykle interesujący. Jakkolwiek nie wszystkie myszy zareagowały wyraźnie na antygen HBs obecny w transgenicznym pokarmie, a tylko u jednej z nich poziom przeciwciał specyficznych wobec antygenu HBs przekroczył we krwi bardzo znacząco, bo 10-krotnie  ochronne minimalne miano przeciwciał, stało się jasne, że istnieje szansa uzyskania ochrony immunologicznej na wirus HBV na drodze immunizacji pokarmowej. Możliwość wywołania odpowiedzi immunologicznej w wyniku pokarmowego podania antygenu HBs wytwarzanego w transgenicznym kalusie łubinu skłoniło do podjęcia prac nad otrzymaniem transgenicznej, jadalnej sałaty z ekspresją antygenów szczepionkowych. W badaniach klinicznych udało się po raz pierwszy wykazać, że również u ludzi poprzez immunizację pokarmową przy użyciu świeżej sałaty wytwarzającej rekombinowane białko HBs można wywołać odpowiedź immunologiczną na poziomie protekcyjnym. Dalsze badania realizowane następnie w Instytucie Genetyki Roślin PAN w Poznaniu oraz w Instytucie Biotechnologii i Antybiotyków w Warszawie potwierdziły ponadto, że sałata poddana liofilizacji, a następnie przechowywana w szczelnym  zamknięciu w temperaturze pokojowej nawet dwa lata, zachowuje immunologicznie czynny antygen szczepionkowy HBs. 

 

 

Czy w Polsce wiele ośrodków wykonuje badania nad opracowaniem nowej formy szczepionek?

 

Józef Kapusta: Jak uprzednio wspomniałem, w Polsce na początku lat 90tych ubiegłego wieku zainicjowano innowacyjny w skali światowej kierunek badań, którego głównym celem było wytworzenie genetycznie modyfikowanych roślin produkujących antygeny szczepionkowe. Koncepcja prof. Andrzeja Płucienniczaka użycia transgenicznych roślin jako producentów szczepionek zyskała aprobatę KBN (Komitet Badań Naukowych) na początku roku 1992. Profesor otrzymał wówczas pisemnie, pozytywną decyzję z datą 17.03.1992, w której informowano, że zgłoszony projekt badawczy pod tytułem „Ekspresja antygenu powierzchniowego (HBsAg) wirusa żółtaczki zakaźnej typu B w komórkach roślin.”, został pozytywnie oceniony przez Zespół Nauk Przyrodniczych, Medycznych i Nauk o Ziemi Komitetu Badań Naukowych i zakwalifikowany do finansowania. Niestety decyzja ta została wkrótce anulowana ze względu na obowiązującą wówczas zasadę finansowania ze środków KBN tylko jednego projektu badawczego. Tymczasem pierwsza praca w tej dziedzinie, publikacja amerykańskich badaczy w Proceedings National Academy of Sciences ukazała się 9 miesięcy później, z datą 15 grudnia 1992 roku. 1  Autorzy pracy zrealizowali w praktyce pomysł Profesora ekspresji w transgenicznym tytoniu antygenu powierzchniowego HBs wirusa zapalenia wątroby typu B. Jeden z autorów amerykańskiej publikacji ok. roku 1990 bawił bowiem w Polsce w laboratorium prowadzonym przez Profesora w Instytucie Wirusologii Molekularnej i Mikrobiologii PAN w Łodzi, gdzie dowiedział o podejmowanych pracach studyjnych nad użyciem  roślin transgenicznych jako swoistych „bioreaktorów” szczepionek. Do dnia dzisiejszego ukazały się tysiące publikacji z tej tematyki, zaś łączna liczba cytowań problematyki szczepionek roślinnego pochodzenia liczy się w dziesiątkach tysięcy. 

 

Jakkolwiek badania w Polsce realizowano z pewnym poślizgiem, należy odnotować, iż w publikacji polskiego zespołu z roku 1999 w FASEB J 2 przedstawiliśmy pionierskie wyniki badań z zakresu pokarmowej immunizacji ludzi i zwierząt za pomocą genetycznie modyfikowanej sałaty wytwarzającej antygen HBsAg wirusa zapalenia wątroby typu B. Uwzględniając wskaźnik cytowań wzmiankowana praca zajmuje silną dziewiątą/dziesiątą pozycję wśród tysięcy oryginalnych prac z zakresu tematyki szczepionek roślinnego pochodzenia (ang. plant-derived vaccine).  Aktualnie badania  kontynuowane są w Instytucie Genetyki Roślin PAN w Poznaniu we współpracy z Instytutem Biotechnologii i Antybiotyków w Warszawie, Instytutem Immunologii i Terapii Doświadczalnej PAN we Wrocławiu oraz Uniwersytetem Przyrodniczym w Poznaniu. Badania z zakresu wytwarzania rekombinowanych szczepionek realizowane są także od końca lat 90tych w zespole prof. Agnieszki Sirko w Instytucie Biochemii i Biofizyki PAN w Warszawie. Obejmują one aktualnie badania nad otrzymaniem w roślinach rekombinowanych szczepionek oraz ludzkich i zwierzęcych immunomodulatorów odpowiedzi immunologicznej takich jak GMCSF oraz IL-4. 

 

Badania nad nową postacią szczepionki ukierunkowane były na zaproponowanie innowacyjnej doustnej formulacji szczepionki przeciwko wirusowemu zapaleniu wątroby typu B  (wzw B) tj. opracowania prototypowej szczepionki w formie tabletki. Prototyp doustnej szczepionki przeciwko wzw B w formie tabletki powstał dzięki współpracy pomiędzy zespołami z Instytutu Genetyki Roślin PAN i Instytutu Roślin i Przetworów Zielarskich w Poznaniu oraz Instytutu Biotechnologii i Antybiotyków w Warszawie 3. 

 

 

Jakie są zalety i wady szczepionek przyjmowanych doustnie?

 

Józef Kapusta: Lwia część wiedzy dotyczącej użycia szczepionek doustnych  pochodzi z doświadczeń aplikowania doustnej szczepionki przeciwko wirusowi Polio. Szczepionka przeciwko chorobie dziecięcego paraliżu, zwanego chorobą Heinego-Medina lub po prostu Polio, opracowana w USA na przełomie lat 40/50 ubiegłego wieku przez prof. Hilarego Koprowskiego, uczonego polskiego pochodzenia, jest doustną szczepionką otrzymaną w wyniku namnażania wirusa Polio w mózgach szczurów bawełnianych.  Szczepionka zawiera, żywe, aczkolwiek atenuowane szczepy wirusa. Pokarmowa droga podania atenuowanego wirusa Polio okazała się właściwa, przede wszystkim  dlatego, że błona śluzowa przewodu pokarmowego stanowi dla tego wirusa naturalne wrota zakażenia. Szczepionka przeciwko Polio okazała się wysoce efektywnym antidotum ponieważ jej szerokie zastosowanie zbliżyło ludzkość do niemal kompletnej eradykacji wirusa. Odpowiedź immunologiczna na preparat szczepionkowy podawany na drodze śluzówkowej zapewnia zarówno tzw. odpowiedź lokalną wyrażającą się generowaniem przeciwciał IgA w obrębie błon śluzowych, jak również systemiczną odpowiedź we krwi, głównie przeciwciał klasy IgG. Zastosowanie doustnej szczepionki  przeciwko Polio indukuje nadto reakcję cytotoksycznych limfocytów dedykowanych do zwalczania komórek gospodarza zakażonych wirusem. Potencjalnie kompleksowa odpowiedź immunologiczna, jaka zostaje wzbudzona w następstwie pokarmowej aplikacji szczepionki stanowi niewątpliwie o atrakcyjności tej drogi podania. Nie bez znaczenia jest także prostota podawania tego rodzaju szczepionek i komfort pacjenta, co nabiera szczególnego znaczenia podczas szczepienia dzieci. 

 

 

Czy w istotny sposób ich skład różni się od tradycyjnych szczepionek? Czy są jednakowo skuteczne?

 

Józef Kapusta: Pierwotna nazwa prototypowych szczepionek doustnych pochodzenia roślinnego, które w początkowym okresie badań określane były dość powszechnie terminem „szczepionek jadalnych”, odzwierciedla istotne cechy tego rodzaju preparatów. Preparat szczepionki otrzymuje się w roślinach genetycznie modyfikowanych, optymalnie roślinach jadalnych, które można spożyć w stanie surowym bez konieczności obróbki termicznej.  Zawierają one rekombinowane białko antygenowe mikroorganizmu chorobotwórczego. Immanentną specyfiką roślin transgenicznych, jest bowiem bardzo duże zróżnicowanie poziomu ekspresji nie tylko pomiędzy liniami transgenicznymi, lecz również w obrębie tego samego egzemplarza rośliny, w zależności od wieku, fazy wzrostu, pozycji liścia względem merystemu wierzchołkowego i merystemów bocznych oraz  usytuowania stref wzrostu merystematycznego w obrębie konkretnego organu. W zależności od typu zastosowanego promotora i rodzaju trans genu, rekombinowane białko może akumulować się głównie w strefie wzrostu poniżej  merystemu (rekombinowane przeciwciała monoklonalne wytwarzane w roślinie pod promotorem małej podjednostki Rubisco) lub całkowicie odmiennie tj. głównie w starszych,  merystematycznie nieaktywnych tkankach  (antygen HBsAg pod kontrolą promotora CaMV wirusa mozaiki kalafiora). 

 

Pierwsze doświadczenia immunizacji doustnej polegały na przyjmowaniu na drodze pokarmowej świeżych roślin transgenicznych wytwarzających rekombinowane białko szczepionkowe. Brak możliwości precyzyjnego ustalenia dawki antygenu szczepionkowego, stanowił przesłankę zaniechania tego typu doświadczeń. Warunkiem otrzymania miarodajnych i powtarzalnych wyników daje jedynie taka procedura, która umożliwia ustalenie dawki podawanego preparatu szczepionkowego. Brak możliwości precyzyjnego dawkowania komponentu szczepionkowego uniemożliwia ocenę efektywności, a co się z tym wiąże porównanie efektywności tzw. szczepionek jadalnych z innymi rodzajami szczepionek i drogami ich podawania. Nadzieję na porównanie szczepionek roślinnego pochodzenia z innymi preparatami szczepionek stwarzają udane eksperymenty polegające na liofilizacji roślinnego materiału szczepionkowego, a następnie ich rozdrabnianiu  np. poprzez mielenie.  Powyższe postępowanie pozwoliło uzyskać amorficzny – jednorodny półprodukt preparatu szczepionkowego w formie proszku. Rozdrobniona tkanka roślinna przekształcona do postaci tabletki, zachowuje immunogenność antygenu przez okres kilkunastomiesięcznego przechowywania w temperaturze pokojowej. 

 

 

Jak wygląda proces produkcji szczepionek doustnych?

 

Józef Kapusta: Wedle posiadanej wiedzy nigdzie na świecie nie został na chwilę obecną uruchomiony proces produkcji szczepionek roślinnego pochodzenia. W ramach produkcji eksperymentalnej w Instytucie Roślin i Przetworów Zielarskich w Poznaniu (obecnie Instytut Włókien Naturalnych i Roślin Zielarskich) wykonywane były krótkie serie produkcyjne preparatu prototypowej szczepionki przeciw wzw B z liofilizowanej sałaty zawierającej antygen powierzchniowy wirusa HBV. Krótkie serie produkcyjne wykonywano przy użyciu profesjonalnej tabletkarki do wytwarzania leków na bazie preparatów zielarskich.

 

 

Czy tego typu produkt będzie konkurencyjny na rynku farmaceutycznym?

 

Józef Kapusta: Wydaje się, że szczepionki roślinnego pochodzenia, tj. rekombinowane szczepionki wytwarzane w roślinach, mogą potencjalnie konkurować na rynku z kilku powodów. Wytwarzanie szczepionek poprzez ich produkowanie w roślinach, może być ekonomicznie efektywniejsze pod warunkiem uzyskania i ustabilizowania odpowiedniego poziomu ekspresji rekombinowanego białka. Możliwość uformowania szczepionki do postaci tabletki, względnie kapsułki stabilnej w temperaturze pokojowej pozwoli z jednej strony na uproszczone aplikowanie tego typu preparatów  bez konieczności asystencji średniego personelu medycznego, z drugiej zaś wyeliminuje potrzebę zachowania tzw. zimnego łańcucha od momentu produkcji szczepionki do etapu aplikacji pacjentowi. Wdrożenie preparatów szczepionkowych w formie tabletki stanowiłoby znaczący krok w kierunku radykalnego uproszczenia metodyki szczepienia, a tym samym pozwoliło na swoisty mentalny przełom dla pacjenta, zwłaszcza dla dzieci, którym szczepienie najczęściej kojarzy się z przykrym doznaniem związanym z iniekcją.

 

 

Literatura

1/Mason i in. 1992. Expression of hepatitis B surface antigen in transgenic plants, PNAS, 89: 11745-11749.

2/ Kapusta i in.  (1999) A plant-derived edible vaccine against hepatitis B virus. FASEB J, 13: 1796-1799.

3/Pniewski i in. (2011) Low-dose oral immunization with lyophilized tissue of herbicide-resistant lettuce expressing hepatitis B surface antigen for prototype plant-derived vaccine tablet formulation, Journal of Applied Genetics, 52: 125-136.

 

 

Portal Biotechnologia.pl serdecznie dziękuje Panu Józefowi Kapuście za udzielenie odpowiedzi do wywiadu.

 

Red. Marta Cipińska