FISH jest jedną z metod hybrydyzacyjnych opartej na homologii fragmentów kwasów nukleinowych. Metoda ta jest szczególnie przydatna w identyfikacji mikroorganizmów.
Do technik najczęściej stosowanych w biotechnologii można zaliczyć PCR( polymerase chain reaction) , elektroforezę żelową , sekwencjonowanie i klonowanie DNA, mikromacierze oraz techniki hybrydyzacyjne.
Podstawą działania hybrydyzacji in situ jest reguła komplementarności zasad w łańcuchu DNA. Komplementarność to sposób parowania zasad azotowych , gdzie adenina (A) tworzy podwójne wiązanie z tyminą (T) a guanina (G) potrójne z cytozyną (C). Chromosom to twór zbudowany z dwóch chromatyd natomiast każda z nich składa się z jednej cząsteczki DNA. Etapem niezbędnym do przeprowadzenia techniki FISH jest denaturacja DNA chromosomów. Powstały jednoniciowy fragment będzie dążyć do odnalezienia komplementarnej nici by się z nią związać. Opisane zjawisko nosi nazwę hybrydyzacji.
Badanie za pomocą techniki FISH polega na wykorzystaniu sond czyli krótkich odcinków DNA o znanej sekwencji oraz lokalizacji na chromosomie. Krótki odcinek DNA stanowiący sondę hybrydyzuje szybciej do DNA na chromosomie niż druga nić , zdecydowanie dłuższa od sondy.
Wyniki hybrydyzacji obserwuje się w mikroskopie fluoroscencyjnym jako barwne sygnały na chromosomach. Sondy są znakowane cząstką fluoroscencyjną, lub inna którą obserwuje się za pomocą fluorescencyjne znakowanych przeciwciał. Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ wymaga występowania DNA badanego preparatu w postaci chromosomów.
Każda hybrydyzacja in situ bez względu na użycie czynnika fluorescencyjnego czy modyfikację przebiega według podobnego schematu. Klasyczna metoda polega na użyciu od jednej do maksymalnie trzech różnie znakowanych sond . Wyróżnia się pięć kategorii sond: centromerowe, malujące , telomerowe , rDNA specyficzne oraz prążkowo specyficzne dla wybranego regionu chromosomu.
Technika FISH znajduje zastosowanie w diagnostyce aberracji strukturalnych chromosomów, wykrywaniu delecji w przypadkach translokacji powstałych de novo, w procesie określania prawidłowej struktury chromosomu, diagnostyce cytogenetycznej komórek nowotworowych i wielu innych.
Metoda doczekała się wielu modyfikacji z czego najczęściej wykorzystuje się następujące metody: CARD-FISH, Clone- FISH, Cat-FISH, RING –FISH, FISH –MAR .
Zastosowanie metody FISH w określeniu OLD fot .Naporowska J
Red. Agata Bednarek
Literatura
Bąkowska K.: Funkcja wybranych fragmentów 16SrRNA małej podjednostki rybosomalnej w procesie biosyntezy białka, Biotechnologia 2005 nr 2
Buchowicz J., Biotechnologia molekularna. PWN,Warszawa 2007
Matejczyk M., Bakteryjne biosensory,Post.Mikrobiol , 2004
Srebniak M. ,Tomaszewska A. „Badania cytogenetyczne w praktyce klinicznej”, Warszawa 2008, Wydawnictwo lekarskie PZWL
KOMENTARZE